白烏魚胴體黏液抗菌活性分析

張龍翼，陳平平，王林果，陳婷婷，張　，熊　偉，郭思亞

(成都大學 肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都　610106)

0　引　言

魚類的皮膚與水環(huán)境直接接觸，其皮膚上覆蓋著一層由上皮細胞和表皮杯狀細胞分泌的黏液.黏液作為魚體的第一道免疫防線，具有滲透壓調節(jié)器、天然潤滑劑、化學信息傳遞介質等多種重要的生理功能[1].研究發(fā)現(xiàn)，魚體存在局部的皮膚黏液免疫系統(tǒng)，具有一定的黏液細胞基礎，能獨立完成抗原攝取、呈遞及抗體分泌功能[2-4].近年來，科研人員對魚胴體黏液在魚類疾病防治以及提取并特征化其中的抗菌活性物質等方面開展了一些研究并取得了一些成果[5-7].白烏魚是一種低脂高蛋白的經(jīng)濟魚類，營養(yǎng)價值較高.白烏魚在宰殺后，其表面有很多的黏液，但目前對其體表黏液的抗菌活性卻鮮有報道.為了更充分地發(fā)掘白烏魚的經(jīng)濟價值，本研究擬對白烏魚胴體黏液的抗菌活性進行分析.

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

1.1.1材料.

實驗所用材料包括：新鮮白烏魚，購自成都龍泉驛區(qū)三聯(lián)汽車城水產(chǎn)市場；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂粉、過硫酸銨(分析純)，購自成都金山化學試劑有限公司；酵母提取物，購自廣州市華粵瑞科科學器材有限公司；氯化鈉(分析純)、鹽酸(36.0%～38.0%)購自成都科龍化工試劑廠；Acrylamide(99%電泳級)，購自上海麥克林生化科技有限公司；Tris、TEMED，購自北京諾其雅盛生物科技有限公司.

1.1.2儀器.

1.2　方　法

1.2.1白烏魚魚胴體黏液的收集.

新鮮白烏魚用自來水暫養(yǎng)，間隔半小時換一次水，連續(xù)3次，宰殺后刮去魚鱗，然后用手(帶乳膠手套)輕捋其體表，讓黏液流入滅菌后的器皿中，分裝后4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2白烏魚魚胴體黏液抑菌活性分析.

分別取2份白烏魚體表黏液10 mL于離心管中，將其中1份黏液在沸水(96 ℃)中煮20 min.將1 mL純水、1 mL新鮮黏液、1 mL變性黏液分別均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長狀況，每組平行3次.分別取不同培養(yǎng)基中的菌落于載玻片上，在生物顯微鏡下觀察每組單體菌落和單個菌體的生長狀態(tài)，分析其菌種的屬性.

1.2.3活性菌種放大培養(yǎng).

用滅菌牙簽挑選新鮮黏液黃色菌、新鮮黏液大菌和變性黏液大菌，分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基放入恒溫振蕩器中，在160 r/min、30 ℃條件下振蕩24 h.

1.2.4菌落蛋白凝膠電泳分析.

用PBS緩沖液洗脫培養(yǎng)基，各取10 mL菌液，在10 000 r/min，離心5 min，倒掉上清液，再加入10 mL PBS緩沖液用旋渦混合器混勻，再離心5 min，重復3次，最后加入5 μL PBS緩沖液混勻，提取到3種放大培養(yǎng)后的蛋白.分別取80 μL放大培養(yǎng)后的蛋白，加入20 μL上樣染色液，在沸水中煮10 min，然后在旋渦混合器中混勻.各取10 μL進樣到電泳儀中，用蛋白質凝膠電泳觀察其蛋白質表達情況.

1.2.5數(shù)據(jù)分析.

所有實驗數(shù)據(jù)利用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析.

2　結果與討論

2.1　魚胴體黏液變性前后的外表特征

由于白烏魚胴體黏液在采集過程容易感染雜菌，為了減少外界雜菌對后期抗菌活性的影響，在實驗中，對黏液進行了加熱處理，加熱處理后的魚胴體黏液見圖1.

A管為未加熱黏液；B管為加熱處理后的黏液

圖1魚胴體黏液變性前后的外表特征

由圖1可知，未加熱魚胴體黏液呈現(xiàn)淡紅色，而加熱處理后的黏液呈淡綠色.未加熱魚胴體黏液呈淡紅色，這可能是魚在去鱗后收集黏液時帶入了一些魚體血液所致；但是經(jīng)過加熱的魚胴體黏液，其顏色呈現(xiàn)淡綠色.通常血色素在加熱以后會呈褐色，而魚胴體黏液加熱后卻呈現(xiàn)淡綠色，對于導致這一現(xiàn)象的原因暫時還不明確.

2.2　魚胴體黏液的抗菌性比較

為了比較魚胴體黏液的抗菌性，取1 mL純水、1 mL新鮮黏液、1 mL加熱處理的黏液，分別均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察微生物的生長狀況，結果如圖2所示.

A：取1 mL純水；B：1 mL新鮮黏液；C：1 mL加熱處理的黏液

圖2魚胴體黏液變性前后的抗菌性比較

由圖2可知，接種了新鮮黏液的培養(yǎng)基主要生長了2種菌落，即黃色菌和大菌，具體為何種微生物根據(jù)菌像難以判斷；而接種了加熱處理的黏液的培養(yǎng)基，只生長了大菌；空白組中無菌落生長.

由培養(yǎng)基上微生物生長狀況可以推測，新鮮和經(jīng)加熱處理的黏液培養(yǎng)基上所長微生物很可能不是空氣中的雜菌.因為黏液熱處理會導致部分雜菌死亡，圖2(B)中不僅有黃色菌又有大菌，而圖2(C)中僅有大菌，而且圖2(B)和圖2(C)中大菌的生長直徑相當.因此，黏液中的大菌與雜菌之間很可能存在競爭性生長，而且黏液中的大菌具有較好的耐熱性，對此有必要做進一步分析.

2.3　菌落的顯微照片

為了更加清晰地觀察培養(yǎng)基上生長菌落的菌像，對菌種進行顯微鏡觀察，拍照結果如圖3所示.

由圖3可知，與對照(圖3(A))相比，新鮮黏液培養(yǎng)基(圖3(B))上的微生物菌像種類較加熱處理黏液(圖3(C))培養(yǎng)基上的菌像種類多.圖中橢圓圈內(nèi)的微生物不僅出現(xiàn)在新鮮黏液培養(yǎng)基上(圖3(B))，而且還出現(xiàn)在加熱處理黏液的培養(yǎng)基上(圖3(C)).由此進一步驗證了“2.2”項的推測，即大菌和黃色菌之間存在競爭性生長現(xiàn)象.

2.4　變性黏液菌落蛋白分析

為了進一步分析大菌的特征，對黏液中的大菌進行了放大培養(yǎng)，并提取其中的蛋白質進行電泳分析，其電泳圖如圖4所示.

A：取1 mL純水；B：1 mL新鮮黏液；C：1 mL加熱處理的黏液

圖3黏液菌落的顯微照片

M為標準蛋白；1道為培養(yǎng)基空白；2道、3道為新鮮黏液黃色菌；4道、5道為新鮮黏液大菌；6道、7道、8道為加熱黏液大菌

圖4變性黏液菌落蛋白分析

圖4顯示，新鮮黏液黃色菌(2道、3道)中主要蛋白的分子量在100～150 kD之間，而且其中的蛋白質種類較多；而新鮮(4道、5道)和加熱黏液(6道、7道、8道)中大菌的蛋白質分布無明顯差異，但含量較黃色菌低.

大菌中的蛋白質含量較低，這可能是大菌較其他雜菌耐高溫處理的可能原因.如果能進一步對大菌中的蛋白質進行分析，那么大菌中的蛋白質很可能具有耐熱等特性，具體情況有待做進一步研究.

3　結　論

通過比較魚胴體黏液變性前后的外表特征，發(fā)現(xiàn)未加熱魚胴體黏液呈現(xiàn)淡紅色，而加熱處理后的黏液呈淡綠色.比較魚胴體黏液的抗菌性，發(fā)現(xiàn)接種了新鮮黏液的培養(yǎng)基主要生長了2種菌落，黃色菌和大菌；而接種了加熱處理的黏液的培養(yǎng)基，只生長了大菌；空白組中無菌落生長.通過電泳分析發(fā)現(xiàn)，新鮮黏液的黃色菌中主要蛋白的分子量在100～150 kD，而且其中的蛋白質種類較多.實驗結果表明，大菌不僅與其他菌間存在競爭性生長特性，而且還表現(xiàn)出較高的耐熱性.