王明鏡 胡曉梅 丁曉慶 許勇鋼 全日城 諶海燕 鄧中陽 趙攀 范騰 朱世榮

摘要 目的：觀察氣不攝血證免疫性血小板減少癥（ITP）患者細(xì)胞免疫功能變化，從細(xì)胞層面探究氣不攝血證ITP的生物學(xué)基礎(chǔ)。方法：選取2016年12月至2017年5月在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院門診就診的ITP確診患者42例，依據(jù)中醫(yī)證候積分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為輕度、中度、重度3組，同時(shí)納入26例體檢健康者作為對(duì)照組，觀察各組Th1、Th2、Th17、Treg、Breg細(xì)胞的表達(dá)比例變化情況，并對(duì)上述免疫細(xì)胞的表達(dá)與中醫(yī)證候積分的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，氣不攝血證ITP患者Breg與Th17細(xì)胞的表達(dá)比例下降，Th1細(xì)胞的表達(dá)比例上升（P<0.05），Th1/Th2呈Th1型（P<0.05），Treg與Th2細(xì)胞的表達(dá)以及Th17/Treg比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，輕度組（P<0.05）、中度組（P<0.05）、重度組（P<0.05）的Breg細(xì)胞的表達(dá)顯著降低，Th1細(xì)胞的表達(dá)和Th1/Th2比值顯著升高，Treg、Th2以及Th17細(xì)胞的表達(dá)、Th17/Treg比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中度組與重度組Breg細(xì)胞的表達(dá)顯著低于輕度組（P<0.05），其他免疫細(xì)胞的表達(dá)與輕度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度組上述免疫細(xì)胞細(xì)胞的表達(dá)與中度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bre細(xì)胞的表達(dá)與中醫(yī)證候積分具有負(fù)相關(guān)性（r=-0.488，P=0.001），其余免疫細(xì)胞無相關(guān)性。結(jié)論：氣不攝血證ITP患者細(xì)胞免疫功能變化表現(xiàn)為Th1細(xì)胞表達(dá)增加導(dǎo)致Th1/Th2失衡。Th17與Breg細(xì)胞表達(dá)水平下降。Breg細(xì)胞表達(dá)水平可能反映了氣不攝血證患者的氣虛嚴(yán)重程度。

關(guān)鍵詞 氣不攝血證；免疫性血小板減少癥；免疫失衡

Abstract Objective：To analyze the immune function changes in patients with immune thrombocytopenia （ITP） with syndrome of qi failing to control blood，then figure out the material basis of the syndrome of qi failing to control blood based on the expressions of immune cells.Methods：According to the traditional Chinese medicine （TCM） syndrome score，42 patients with ITP in our hospital from December 2016 to May 2017 were separated into mild group （MIG），moderate group （MOG），and severe group （SG）.Twenty-six healthy people were as control group （CG）.The expressions of Th1，Th2，Th17，Treg and Breg and the relationship between the expressions of them and the TCM syndrome scores were analyzed.Results：As comparison with CG，the expressions of Breg and Th17 were lower （P<0.05），while the Th1，Th1/Th2 were higher （P<0.05） in the ITP patients.The expressions of Th2，Treg and Th17/Treg in ITP patients had no significant differences with those in CG.The expressions of Breg were lower，while as the expressions of Th1 and Th1/Th2 were higher in MIG （P<0.05），MOG （P<0.05），and SG （P<0.05） than those in CG.The expressions of Th2，Treg and Th17/Treg in the three groups had no significant differences with those in CG.As compared with MIG，all of the expressions of immune cells had no significant differences in MOG and SG，except the Breg.The expression of Breg in MOG （P<0.05） and SG （P<0.05） was lower than those in MIG.All the expressions of immune cells had no significant differences between in MOG and in SG.There were negative correlations between expression level of Breg and TCM syndrome scores （r=-0.488，F(xiàn)=0.001）.The other expressions of immune cells had no correlations with TCM syndrome scores.Conclusion：The higher level of Th1 expression leading to the imbalance of Th1/Th2 and the decreasing expressions of Th17 and Breg might be the signatures of ITP with TCM syndrome of qi failing to control blood.The level of Breg expression might indicate the level of Qi deficiency.

Key Words Syndrome of qi failing to control blood； Immune thrombocytopenia； Immune imbalance

中圖分類號(hào)：R255.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.009

免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenia，ITP）是一種以血小板減少為主要表現(xiàn)的常見的免疫相關(guān)疾病，臨床表現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)不同程度的減少、伴或不伴皮膚黏膜、臟器出血癥狀，屬于中醫(yī)“血證”“紫癜病”范疇。氣不攝血證是ITP常見證型之一[1]。依據(jù)中醫(yī)血證理論，氣虛則無力攝血，進(jìn)而血不循經(jīng)，旁溢而出。長期以來現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)ITP的認(rèn)識(shí)是從免疫角度出發(fā)，祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的切入點(diǎn)則是從氣血脈之間的相互聯(lián)系，筆者認(rèn)為找出2種思維方式之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系有助于從更深層次揭示ITP發(fā)病機(jī)制，也有助于挖掘人體在ITP疾病狀態(tài)下氣對(duì)血的作用進(jìn)而有益于發(fā)現(xiàn)中醫(yī)氣不攝血證的發(fā)生、發(fā)展全過程，同時(shí)對(duì)探究中醫(yī)氣血理論的物質(zhì)基礎(chǔ)提供必要的參考資料。本研究遴選42例符合中醫(yī)辨證氣虛型血證ITP診斷的患者進(jìn)行研究，并以26例體檢健康者作為對(duì)照組，觀察Th1、Th2、Th17、Treg、Breg細(xì)胞表達(dá)變化情況，并對(duì)上述免疫細(xì)胞與中醫(yī)證候積分的相關(guān)性進(jìn)行分析，擬從免疫細(xì)胞的層面入手，探討氣不攝血證ITP與免疫細(xì)胞變化與中醫(yī)氣不攝血證的關(guān)系，為研究中醫(yī)氣血理論的相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)找到新的路徑與方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年12月至2017年5月在中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院與北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院門診就診的ITP確診患者42例，男18例，女24例，年齡18～68歲，中位年齡49歲，對(duì)照組28例為我院體檢健康志愿者，男14例，女14例，年齡21～55歲，中位年齡45歲。年齡和性別與觀察組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2015XLA108-2）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 1）西醫(yī)診斷：所有入選患者均參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(shí)（2012年版）》[2]。2）中醫(yī)證候診斷：參照國家中醫(yī)藥管理局2010年出版的中醫(yī)血液病重點(diǎn)?？谱像安。庖咝匝“鍦p少癥）中醫(yī)診療方案[3]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合免疫性血小板減少癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程≥3個(gè)月；符合氣不攝血證；年齡在18～75歲之間。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重消化道和（或）臟器出血；臟器功能不全：血肌酐大于正常值上限；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸酶、膽紅素大于正常值的2倍；NYHA分級(jí)≥Ⅱ級(jí)；妊娠、哺乳期婦女、過敏體質(zhì)者。

1.5 主要儀器 FITC標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體、抗人CD38單克隆抗體、抗人IFN-γ單克隆抗體，PE標(biāo)記的抗人CD25單克隆抗體、抗人CD24單克隆抗體，PC5標(biāo)記的抗人CD19單克隆抗體、抗人CD4單克隆抗體、抗人IL-4單克隆抗體，APC標(biāo)記的抗人CD127單克隆抗體、抗人IL-17A單克隆抗體，均為美國BD公司生產(chǎn)。流式細(xì)胞儀（EPICS ELITE型，BD公司）、Shel.LABCO2培養(yǎng)箱，美國SHELDON公司。RPMI1640培養(yǎng)液、紅細(xì)胞裂解液OptiLyseC購自美國BD公司。

1.6 研究方法

1.6.1 外周血采集及處理 實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組，每個(gè)人取2 mL外周靜脈血，其中1 mL用于檢測(cè)Th1、Th2、Th17細(xì)胞群的樣本采用肝素鈉抗凝，另外1 mL用于檢測(cè)Treg、Breg細(xì)胞群的樣本采用EDTA抗凝。PBMC由密度梯度離心法分離，PBMC密度調(diào)整為1×109/L，加入20 μL CD4PC5避光靜置30 min后加入1 mL胎牛血清的RPMI640培育液懸浮PMBC，37 ℃孵箱中18 h培養(yǎng)；具體操作按照試劑盒要求，配制完畢等待上機(jī)檢測(cè)。

1.6.2 PBMC免疫細(xì)胞FCM檢測(cè) 開機(jī)后Flow-Check校準(zhǔn)光路，并自動(dòng)設(shè)定實(shí)驗(yàn)的獲取條件，包括PMT電壓和熒光補(bǔ)償，然后進(jìn)入自動(dòng)分析軟件，以FSC/SSC設(shè)門，確定淋巴細(xì)胞群，獲取1×104個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用EXPO 32軟件分析。

1.6.3 氣不攝血證程度分級(jí) 參照國家中醫(yī)藥管理局2010年出版的中醫(yī)血液病重點(diǎn)專科紫癜?。庖咝匝“鍦p少癥）診療方案，氣不攝血證主要臨床癥狀與體征：皮膚紫癜、鼻衄、齒衄、月經(jīng)量多、神疲乏力、氣短、頭暈?zāi)垦?、面色不華、少食、便秘、便溏。量化評(píng)分：無（0分）、輕微（2分）、中等（4分）、顯著（6分）。最后統(tǒng)計(jì)每一粒入組患者的評(píng)分結(jié)果。證候分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1）輕度：總分≤22分；2）中度：總分：22～44分；重度≥44分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。分組之間的比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣不攝血證ITP患者細(xì)胞免疫功能變化 氣不攝血證ITP患者與健康對(duì)照組Th1、Th2、Th17、Treg、Breg細(xì)胞表達(dá)變化，以及Th1/Th2、Th17/Treg結(jié)果如表1所示。與正常人對(duì)照組比較，氣不攝血證ITP患者Treg、Breg、Th17、Th2細(xì)胞比例下降，Th1細(xì)胞比例上升，Breg、Th17、Th1細(xì)胞、Th1/Th2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Treg、Th2細(xì)胞，Th1/Th2、Th17/Treg差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 不同程度氣不攝血證ITP患者細(xì)胞免疫功能變化 輕度組、中度組、重度組ITP患者與健康對(duì)照組Th1、Th2、Th17、Treg、Breg細(xì)胞比例變化，以及Th1/Th2、Th17/Treg比值結(jié)果如表2所示。與對(duì)照組比較，輕度組、中度組、重度組的Breg細(xì)胞表達(dá)均顯著降低（P<0.05），輕度組、中度組、重度組的Th1細(xì)胞表達(dá)、Th1/Th2比值均顯著升高（P<0.05），Treg、Th2、Th17細(xì)胞表達(dá)、Th17/Treg比值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中度組與重度組的Breg細(xì)胞表達(dá)顯著低于輕度組，而中度組、重度組的其他免疫細(xì)胞與輕度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。重度組的上述免疫細(xì)胞與中度組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 Breg細(xì)胞表達(dá)與氣不攝血證程度的相關(guān)性 Breg細(xì)胞表達(dá)與氣不攝血證積分的相關(guān)性分析如圖1所示，r=-0.488，P=0.001，表明Breg細(xì)胞表達(dá)與氣不攝血證程度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。而Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)與氣不攝血證程度未顯示相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

ITP以皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血為主要的臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)的“血證”“虛勞”等范疇，目前統(tǒng)稱為“紫癜病”[3]。氣不攝血證是中醫(yī)“血證”的常見證型之一[1]，氣虛不攝則血不歸經(jīng)，發(fā)生各種病證。歷代醫(yī)家關(guān)于氣虛引發(fā)“血證”的論述頗為豐富：《醫(yī)述·血證》：“氣虛不統(tǒng)者，血必散漫”?！毒霸廊珪ぱC》：“損者多由于氣，氣傷則血無以存”。清代醫(yī)家吳澄更是從“天地之道”將氣虛與出血的關(guān)系進(jìn)行概括：“天地之道，無形者依有形，有形者附無形，互相依附。天地之道，亦即氣血之道也。氣之高，未有不由于血之散，而血之脫未有不由于氣之虛。所以善治者，不治其血，而專治其氣。氣旺則陽能統(tǒng)陰，而血自歸經(jīng)矣”。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為ITP的發(fā)病與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能失常導(dǎo)致血小板生成障礙或血小板破壞過度有關(guān)，其中T、B淋巴細(xì)胞亞群分泌異常而導(dǎo)致的免疫失衡是主要的發(fā)病機(jī)制之一，涉及到Th1、Th2、Th17、Treg、Breg數(shù)量異常，以及Th1/Th2、Th17/Treg失衡[4-7]。Th1細(xì)胞能有效介導(dǎo)細(xì)胞免疫，主要作用是增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，特別是抗胞內(nèi)病原體的感染；Th2細(xì)胞可以刺激體液免疫，參與變態(tài)反應(yīng)、對(duì)抗細(xì)胞外多細(xì)胞寄生蟲感染[8-9]。Th17細(xì)胞在防御胞內(nèi)細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答、介導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，參與了多種急慢性免疫性疾病的發(fā)病[10]。Treg細(xì)胞是一種具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)。Breg是一群能在多種免疫性疾病中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)的作用且與分泌免疫球蛋白無關(guān)聯(lián)的B細(xì)胞亞群，可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化[11]，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[12]，抑制原始T細(xì)胞分化為Th1、Th17細(xì)胞[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，氣不攝血證ITP患者Th1細(xì)胞分泌顯著高于對(duì)照組，Th2細(xì)胞分泌與對(duì)照組比無顯著差異，Th1/Th2存在失衡現(xiàn)象且傾向于Th1型；Th17細(xì)胞分泌低于對(duì)照組，Treg分泌情況與對(duì)照組無顯著差異，Th17/Treg與對(duì)照組比較無顯著差異；Breg分泌顯著低于對(duì)照組。既往認(rèn)為，ITP患者Th1分泌水平升高，Th2細(xì)胞降低，Th17水平升高，Treg分泌降低，進(jìn)而Th1/Th2失衡、Th17/Treg失衡，即炎性反應(yīng)因子分泌過多而抑炎因子分泌不足導(dǎo)致ITP發(fā)病[14-16]。我們認(rèn)為，氣不攝血證ITP患者發(fā)病機(jī)制主要是由于Breg細(xì)胞分泌不足，對(duì)Th1細(xì)胞抑制不足，導(dǎo)致Th1分泌過量，同時(shí)Th17向Th1發(fā)生了轉(zhuǎn)換，加劇Th1/Th2失衡，Th2細(xì)胞與Treg細(xì)胞未參與到氣不攝血證的發(fā)病過程，與既往的研究結(jié)果不盡相同。Henriques研究發(fā)現(xiàn)Th17可以產(chǎn)生IL-2、TNF-α、IFN-γ等Th1型細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1型極化[16]，與我們的觀點(diǎn)一致。另外，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β對(duì)Th17細(xì)胞的分化起促進(jìn)作用[17]，而IFN-γ可以通過抑制TGF-β相關(guān)信號(hào)，干擾TGF-β對(duì)Th17細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的分化數(shù)量[18]，而IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌，據(jù)此，我們認(rèn)為，Th1細(xì)胞可以抑制Th17生成，高表達(dá)的Th1細(xì)胞會(huì)造成Th17分泌減少。Adams[19]等研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者可以出現(xiàn)Th1細(xì)胞數(shù)量減少、Th17分泌數(shù)量增多的情形，與我們的研究相反，但其納入的ITP患者中醫(yī)證型未知，因此，我們認(rèn)為ITP發(fā)病復(fù)雜多樣，需要進(jìn)一步細(xì)化入組標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大樣本量深入研究。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，Breg的分泌與中醫(yī)證候積分具有顯著負(fù)相關(guān)性，輕度組、中度組、重度組3組之間Breg的分泌呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì)，當(dāng)Breg分泌降低時(shí)，中醫(yī)證候積分顯著升高，意味著患者氣不攝血相關(guān)中醫(yī)癥狀加重。據(jù)此我們推斷，Breg細(xì)胞異常影響到氣對(duì)血的固攝功能，Breg的變化間接的反映了此型ITP患者的氣虛嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果表明，細(xì)胞免疫功能的變化，反映了氣不攝血證ITP的發(fā)病機(jī)制與生物學(xué)基礎(chǔ)，也為中醫(yī)益氣攝血法治療氣虛型ITP以及其他“血證”提供了生物學(xué)依據(jù)。

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