李奕萱 王巖飛 李姝玉 劉朝霞 張達 趙福建 張淑靜 高譽珊 趙淑英 王謙

摘要 目的：觀察黃芪注射液與葛根素注射液合用對糖尿病心臟損害的干預(yù)作用。方法：選取60只KKAy雄性小鼠，以高脂飼料飼喂的建立2型糖尿?。═2DM）小鼠模型，將30只C57BL/6J雄性小鼠作為其正常對照組。用高脂飼料飼喂4周后（即12周齡時）把隨機血糖≥13.9 mmol/L的小鼠隨機分為觀察組和模型組，分別注射黃芪注射液與葛根素注射液或等量生理鹽水，給藥8周、12周及16周后分批次處理小鼠，觀察小鼠一般體征，檢測其血液生化指標(biāo)，觀察心肌組織形態(tài)并運用TUNEL法檢測細胞凋亡水平。結(jié)果：黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)用能夠改善2型糖尿病小鼠精神不佳，尿量增多，毛發(fā)欠光澤，肥胖等各種情況，對給藥6周和給藥12周糖尿病小鼠能顯著降低其空腹血糖及血脂（P<0.05），減少心肌細胞凋亡，改善心肌組織纖維化，但是給藥16周效果不明顯。結(jié)論：黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)合使用能夠使2型糖尿病小鼠的一般狀態(tài)得到顯著改善，對模型小鼠的高血糖和高血脂有降低作用，可抑制心肌細胞凋亡并減輕心臟纖維化。

關(guān)鍵詞 黃芪注射液；葛根素注射液；糖尿??；心臟損害；KKAy小鼠

Abstract Objective：To observe the effects of astragalus injection combined with puerarin injection on diabetic heart damage，and to lay a foundation for further study of its mechanism.Methods：Male KKAy mice （n=60） were fed with high fat diet to establish type 2 diabetes mellitus.Male C57BL/6J mice （n=30） with the same age were included into normal group.Mice with 12 weeks of age were randomly divided into treatment group and model group.The KKAy mice were injected with astragalus injection and puerarin injection or the same amount of normal saline.After feeding at 8th，12th and 16th weeks，the general signs of mice were observed to detect the levels of the fasting blood glucose （FBG），serum triglyceride （TG），and total cholesterol （TCHO）.The morphological myocardial tissue was observed，and TUNEL method was used to detect the level of apoptosis.Results：Astragalus injection combined with puerarin injection could improve the symptoms of type 2 diabetes mellitus，slow activity，significant increase in urine output，lack of luster of body hair，body fat and other symptoms.After 6 weeks and 12 weeks treatment，it can significantly reduce FBG，TG and TCHO （P<0.05），reduce myocardial cell apoptosis，improve myocardial fibrosis，but 16 weeks treatment was not significantly effective.Conclusion：The use of astragalus injection and puerarin injection can significantly improve the general state of type 2 diabetic mice，reduce FBG，TG and TCHO，inhibit myocardial cell apoptosis and reduce cardiac fibrosis.

Key Words Astragalus injection； Puerarin injection； Diabetic cardiac injury； Diabetic heart injury； KKAy mice

中圖分類號：R289.5；R287.1文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.037

糖尿病患者持續(xù)的高血糖狀態(tài)會引起非常嚴重的心血管、眼、腎及神經(jīng)系統(tǒng)病變。其中糖尿病心血管病變是糖尿病最常見的致死和致殘原因。糖尿病心臟病（Diabetic Cardiopathy，DC）主要包括心絞痛、心肌梗死、卒中、周圍動脈疾病和充血性心力衰竭[1]。研究表明，糖尿病早期便出現(xiàn)心肌纖維肥大。同時心肌纖維間發(fā)生過碘酸希夫反應(yīng)（PAS）陽性物質(zhì)沉積，心肌纖維局灶性片狀壞死，心臟毛細血管基膜增厚。而冠狀動脈的病變的出現(xiàn)晚于心臟微血管病變[2]。因此，關(guān)注糖尿病心肌纖維化對于防治糖尿病心血管并發(fā)癥有著尤為重要的意義。

黃芪以及葛根是治療糖尿病及其并發(fā)癥的常用藥物，被廣泛應(yīng)用于臨床。中醫(yī)認為黃芪補氣活血，葛根生津升陽。兩藥相合，相輔相成，共奏益氣活血、養(yǎng)陰生津之功，多應(yīng)用于證屬氣陰兩虛之糖尿病。本研究通過觀察黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)用對KKAy不同周齡糖尿病小鼠一般情況、心肌組織形態(tài)學(xué)的影響及心肌細胞的凋亡水平，研究其對糖尿病心臟損害的干預(yù)作用，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

C57BL/6J小鼠30只，KKAy小鼠60只，均為SPF級，許可證編號均為SCXK（京）2013-0002，雄性，8周齡，實驗小鼠的體重均為22～25 g，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。

實驗過程中，動物自由飲水，KKAy小鼠給予高脂飼料（其成分為0.5%膽酸鈉+20%蔗糖+2.5%膽固醇+67%基礎(chǔ)飼料+10%豬油），C57BL/6J小鼠給予普通飼料。實驗動物均飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院實驗動物中心屏障系統(tǒng)。

1.1.2 藥物

黃芪注射液于成都地奧九泓制藥廠訂購（批號1404163）。葛根素注射液于湖南五洲通藥業(yè)有限責(zé)任公司訂購（批號1009056）。4%多聚甲醛于北京普博欣生物科技有限公司訂購，分析純二甲苯、分析純無水乙醇均于北京化學(xué)工業(yè)集團有限公司訂購，PBS于中杉金橋生物技術(shù)有限公司（北京）訂購，Masson試劑盒（批號：20150602）、TUNEL凋亡試劑盒（批號：20150815）購自凱基生物技術(shù)股份有限公司（江蘇）。

1.1.3 試劑與儀器

拜耳拜安捷2血糖測量儀（1455）及其配套血糖試紙（1481）產(chǎn)自德國拜爾，全自動生化分析儀（美國貝克曼公司，型號：AU5421），萊卡包埋機（EG1140H）、萊卡切片機（RM2135），光學(xué)顯微鏡（IMT-2）購自日本Olypus公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

本研究分為正常組（30只）、模型組（30只）以及觀察組（30只）。將購進的8周鼠齡的小鼠用不同的飼料飼喂。其中，正常組為普通飼料喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠。KKAy小鼠用高脂飼料喂養(yǎng)至12周齡，測定其隨機血糖，將血糖≥13.9 mmol/L的小鼠隨機分為模型組和觀察組。觀察組和模型組小鼠在實驗過程中一直給予高脂飼料。

1.2.2 給藥方法

正常組及模型組的小鼠每日均給予腹腔注射生理鹽水4.3 mL/kg。觀察組小鼠先后注射黃芪注射液以及葛根素注射液（分別為3 mL/kg、1.3 mL/kg）。以上各組小鼠均單獨飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，毎日更換墊料，分別于給藥8、12、16周后分批處理動物，檢測其指標(biāo)。在其被處死前，每周均檢測空腹血糖，監(jiān)測小鼠是否一直處于高血糖的水平。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1）血液生化指標(biāo)檢測：小鼠分別在給藥8、12、16周后，于空腹?fàn)顟B(tài)下摘眼球取血1 mL，離心取血清，檢測空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）以及三酰甘油（TG）。

2）HE染色與Masson染色形態(tài)學(xué)觀察：動物處死后取材，剪下心臟組織，石蠟包埋后分別進行HE染色以及Masson染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

3）TUNEL法檢測心肌細胞凋亡：將處理好的石蠟切片按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行實驗操作，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)以SPSS 20.0統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析進行處理，計量資料以（±s）表示。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，各組均呈正態(tài)且方差齊時，用單因素方差分析（F檢驗），同時做LSD兩兩比較；任意一組數(shù)據(jù)非正態(tài)或方差不齊時做Kruskal-Wallis H檢驗（H檢驗），以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般情況比較 與正常組比較，模型組與觀察組均出現(xiàn)精神不佳的表現(xiàn)，其行動緩慢，肥胖體型，體毛欠光澤，尿量變多，且隨著周齡的增加而加重。觀察組與模型組比較，發(fā)現(xiàn)以上各種情況均得到一定程度的改善。

2.2 3組血液生化指標(biāo)比較 在小鼠給藥8、12、16周后，模型組的FBG、TG及TC均高于正常組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同時觀察組與模型組比較，給藥8、12周時指標(biāo)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。給藥16周差異不明顯。見表1～3。

2.3 心肌形態(tài)變化的觀察

HE染色，正常組小鼠的心肌細胞結(jié)構(gòu)正常。模型組的心肌細胞出現(xiàn)輕度萎縮、少許細胞有胞質(zhì)溶解，甚至出現(xiàn)壞死。觀察組的心肌細胞較模型組有一定程度的改善。給藥12周后其心肌組織HE染色見圖1。

Masson染色，正常組小鼠的心肌細胞間出現(xiàn)少許膠原。模型組小鼠的心肌細胞間基質(zhì)卻產(chǎn)生較多的膠原堆積。觀察組的膠原堆積與模型組比較明顯減少。給藥12周后其心肌組織見圖2。

2.4 細胞凋亡水平的檢測

以TUNEL法來測細胞凋亡水平，表明正常組的心肌細胞有少量細胞凋亡，相比之下模型組小鼠的心肌細胞凋亡明顯增強。觀察組與模型組比較凋亡有所減輕。給藥12周后其心肌組織細胞凋亡水平見圖3。

3 討論

糖尿病心臟損傷在中醫(yī)上無專屬病名，可歸屬為由“消渴”引發(fā)的“心悸”“胸痹”等癥。由于糖尿病日久及心，陰虛燥熱而耗傷津液，氣血陰陽虧虛致使心神失養(yǎng)，心脈痹阻，發(fā)為本病，病性為本虛標(biāo)實，同時可能伴隨虛實夾雜的情況。中醫(yī)辨證分型中主要有氣虛、陰虛內(nèi)熱、瘀血閉阻等證型，其中氣陰兩虛最為常見[3]。

《神農(nóng)本草經(jīng)》中曾論述到：“藥有陰陽配合，子母兄弟”?！捌咔椤崩碚撘鄰娬{(diào)藥物之間各種相互關(guān)系能夠?qū)M方產(chǎn)生深遠的影響。其中，黃芪與葛根作為治療氣陰兩虛型糖尿病的常用藥物被廣泛應(yīng)用[3-4]。黃芪其味甘，性微溫，可補脾肺元氣而升清陽。藥理研究證明，黃芪能夠擴張血管、降低血壓，對抗腎上腺素作用，同時具有利尿作用；葛根其味甘而辛，性平，可升清陽，鼓舞胃氣上行并生津。藥理研究發(fā)現(xiàn)，葛根對腦及冠狀動脈血流量的流通具有積極的作用，對由心肌缺血（主要為垂體后葉素所引發(fā)）具有一定的治療作用。黃芪與葛根相合，相輔相成，從而能夠共奏補氣活血、養(yǎng)陰生津之效[5]。

我們從臨床療效觀察及動物基礎(chǔ)實驗中均已證實，心肌功能的損傷在糖尿病早期階段已經(jīng)出現(xiàn)[6-7]。Baynes和Murray[8]也認為糖尿病心肌病早期階段便發(fā)生了左心室肥大，心肌纖維化，從而導(dǎo)致心臟收縮和舒張功能的增加，心肌順應(yīng)性降低，心律不齊等，最終可誘發(fā)心力衰竭。Heaberlin等[9]研究表明，KKAy小鼠誘發(fā)糖尿病后通過改善心臟功能能夠顯著降低死亡率。而更為重要的是，糖尿病心肌損害的關(guān)鍵始動因素之一即為高血糖。持續(xù)高水平的血糖與心肌纖維化的嚴重程度成正相關(guān)，其通過心臟成纖維細胞刺激轉(zhuǎn)化生長因子的過表達導(dǎo)致纖維組織沉積以及細胞外基質(zhì)的合成增多。同時我們發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化的發(fā)生亦與心肌細胞凋亡的關(guān)系密切。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，心肌細胞凋亡相關(guān)的多條通路被激活，從而促使心肌重構(gòu)，心肌纖維化形成[10]。因此，本研究通過對比觀察中藥作用后不同組別的血清生化指標(biāo)、心肌組織形態(tài)學(xué)變化以及心肌細胞凋亡水平的差別，探討這兩藥對糖尿病心臟損害的干預(yù)作用。

黃芪注射液，為黃芪提取物處理的水溶液（生藥量為0.5 mL/g），其成分包含氨基酸、皂苷、多糖、黃酮以及微量元素等。葛根素注射液，為葛根提取物處理的水溶液（生藥量為0.02 mL/mg），其化學(xué)成分主要是葛根黃酮。實驗研究證明，黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)用對慢性心力衰竭及心肌炎具有顯著的治療作用，能夠降低血糖并有利于心肌重構(gòu)[11]。而本課題組前期實驗結(jié)果中得知，單獨運用黃芪注射液或葛根素注射液或兩藥聯(lián)用，均對KKAy糖尿病小鼠的腎臟、肝臟及腦血管具有保護作用[12-14]。同時我們已研究發(fā)現(xiàn)，單用葛根素便可使KKAy糖尿病小鼠心肌細胞凋亡得到抑制[15]。為了進一步明確兩藥聯(lián)用是否對心臟具有保護作用并進行機制探索，我們進行了一系列生化指標(biāo)的檢測以及組織形態(tài)學(xué)檢測。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠給藥8周和給藥12周時，2藥聯(lián)用能夠顯著改善空腹血糖、血脂和膽固醇水平，但在給藥16周時效果不明顯，其原因還需繼續(xù)深入探討。通過組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，模型組心肌細胞外基質(zhì)中有大量膠原纖維堆積，細胞發(fā)生萎縮、壞死，而觀察組膠原纖維與模型組比較有明顯減少，細胞凋亡減少。因此可以得出結(jié)論，兩藥聯(lián)用能夠降低血糖，改善心肌纖維化，減少細胞凋亡，對心臟具有保護作用。其進一步的作用機制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有關(guān)，需要進一步深入探討。

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