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      麥胚凝集素修飾的長春瑞濱陽離子脂質(zhì)體的處方優(yōu)選及細(xì)胞毒性試驗(yàn)

      2018-07-12 17:36:26肖瑤王鑫符敏劉晶晶李學(xué)濤程嵐
      中國藥房 2018年5期
      關(guān)鍵詞:響應(yīng)面法含量測定

      肖瑤 王鑫 符敏 劉晶晶 李學(xué)濤 程嵐

      中圖分類號 R943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408(2018)05-0611-04

      DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.09

      摘 要 目的:制備麥胚凝集素(WGA)修飾的長春瑞濱(VRB)陽離子脂質(zhì)體(WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體),優(yōu)化處方并進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。方法:以磷脂、膽固醇為輔料,以3β-[N-(N′ -N′ -二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽(DC-Chol)為陽離子材料,以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)為長循環(huán)鏈,采用薄膜分散法及硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。以包封率為指標(biāo),采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化處方中DC-Chol、膽固醇和VRB用量。測定所制VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體中VRB含量,比較二者和空白陽離子脂質(zhì)體作用于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549后對細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果:5 mL WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為磷脂22 mg、膽固醇12 mg、DC-Chol 8 mg、VRB 0.5 mg,其包封率為(92.24±1.21)%(n=3),與預(yù)測值的相對誤差為5.3%。VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體中VRB含量分別為(96.01± 3.26)、(93.39±1.59) μg/mL(n=3);與空白陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體比較,WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體可明顯降低MCF-7、A549細(xì)胞的存活率(P<0.05)。結(jié)論:成功制得WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體,其對MCF-7、A549細(xì)胞存活的抑制作用強(qiáng)于VRB脂質(zhì)體。

      關(guān)鍵詞 麥胚凝集素;長春瑞濱;陽離子脂質(zhì)體;處方優(yōu)選;星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法;含量測定

      ABSTRACT OBJECTIVE: To prepare Wheat germ agglutinin (WGA) modified vinorelbine (VRB) cationic liposomes (WGA-VRB cationic liposomes), and to optimize the formulation and conduct cytotoxicity test. METHODS: Thin-film diffusion and ammonium sulfate gradient method were used to prepare WGA-VRB cationic liposomes using phospholipid and cholesterol as excipient, 3β-[N-(N′ -N′ -dimethyl aminoethane)-carbamoyl] cholesterol hydrochloride (DC-Chol) as cationic material, distearoyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000 (DSPE-PEG2000) as long cycle chain. Using encapsulation rate as index, central composite design-response surface methodology was used to optimize the amount of DC-Chol, cholesterol and VRB. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were determined. The effects of them and blank cationic liposomes on survival rates of human breast cancer cell MCF-7 and human non-small cell lung cancer cells A549 were compared. RESULTS: The optimal formulation of 5 mL WGA-VRB cationic liposomes was as follows as phospholipid 22 mg, cholesterol 12 mg, DC-Chol 8 mg, VRB 0.5 mg. Encapsulation rate of the liposomes was (92.24±1.21)%(n=3), relative error of which to predicted value was 5.3%. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were (96.01±3.26),(93.39±1.59) μg/mL(n=3). Compared with blank cationic liposomes and VRB liposomes, WGA-VRB cationic liposomes could significantly reduce survival rate of MCF-7 and A549. CONCLUSIONS: WGA-VRB cationic liposomes are prepared successfully. Inhibitory effect of WGA-VRB cationic liposomes on MCF-7 and A549 cell survival is stronger than that of VRB liposomes.

      KEYWORDS Wheat germ agglutinin; Vinorelbine; Cationic liposomes; Formulation optimization; Central composite design- response surface methodology; Content determination

      麥胚凝集素(WGA)是從小麥胚芽中提取的一種能與專一性糖結(jié)合、促進(jìn)細(xì)胞凝集的二聚體蛋白質(zhì)。研究表明將其與藥物或載體結(jié)合,可借助凝集素對癌細(xì)胞的親和作用增強(qiáng)抗癌活性[1]。脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層組成的類生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),有降低藥物不良反應(yīng)、提高藥物體內(nèi)靶向性的優(yōu)點(diǎn)[2]。但普通脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)周期短、主動靶向性弱,限制了脂質(zhì)體的進(jìn)一步應(yīng)用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),與正常細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞膜表面通常帶有較多的負(fù)電荷[5]。陽離子脂質(zhì)體是利用陽離子磷脂材料制備成表面帶有正電荷的靶向給藥制劑[6],陽離子脂質(zhì)體可通過與腫瘤細(xì)胞膜的靜電吸附作用提高藥物的主動靶向效果。長春瑞濱為人工半合成類生物堿,廣泛應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、食管癌等研究[7]。本課題制備WGA修飾的長春瑞濱(VRB)陽離子脂質(zhì)體(WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體),通過凝集素與腫瘤細(xì)胞的主動親和作用[8]以及陽離子脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞膜的靜電吸附作用來增強(qiáng)VRB對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體處方,測定脂質(zhì)體中VRB的含量并比較VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549存活率的影響。

      1 材料

      1.1 儀器

      FA1004電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司);RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技公司);PHS-25pH計(上海精密科學(xué)儀器公司);20AT液相色譜儀與紫外檢測器(日本島津公司);WJ-80B-Ⅱ二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);HBS-1096A酶標(biāo)分析儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

      1.2 藥品與試劑

      WGA蛋白(瑞典Medicago公司,批號:050102100,含量:>98%);二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000,上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司); VRB原料藥、VRB對照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司,批號:MB20886、MB5301,純度:>98%、≥98%);葡聚糖凝膠Sephadex G-50(北京索萊寶科技有限公司);卵磷脂(日本NOF公司);膽固醇(普邁生物科技公司); 3β-[N-(N′ -N′ -二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽(DC-Chol,美國Avanti公司);胎牛血清(FBS)和RPMI-1640培養(yǎng)液(北京邁晨科技有限公司);胰蛋白酶(美國Gibco公司);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(無錫耐思生物科技有限公司);甲醇、氯仿、三乙胺、磷酸等均為分析純。

      1.3 細(xì)胞

      MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的制備

      以磷脂、膽固醇為輔料,以DC-Chol為陽離子材料,以DSPE-PEG2000為長循環(huán)鏈,采用薄膜分散法和硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。取處方量磷脂、膽固醇、DC-Chol、DSPE-PEG2000,加氯仿溶解,40 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻脂膜,加入250 mol/L (NH4)2SO4水溶液5 mL,超聲水化(功率180 W),然后超聲10 min(超聲時間與間歇時間各10 s,功率200 W),過0.22 μm微孔濾膜2次,過膜后密封于透析膜袋中(截留分子量12 000~14 000 Da),以磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH為7.2~7.4)為透析介質(zhì),透析3次,每次8 h,加入WGA 2 mg,室溫勻速攪拌2 h,得空白陽離子脂質(zhì)體??瞻钻栯x子脂質(zhì)體中加入處方量的VRB原料藥,40 ℃水浴振搖20 min,即得。

      2.2 VRB的含量測定

      2.2.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[9],色譜柱:Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.06 mol/L KH2PO4(0.3%三乙胺)(33 ∶ 67,V/V,磷酸調(diào)pH=4.0);流速:1.0 mL/min;檢測波長:267 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

      2.2.2 溶液的制備 取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體1 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇破乳定容,制成供試品溶液。取VRB對照品適量,甲醇溶解稀釋制成質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為對照品溶液。取空白陽離子脂質(zhì)體1 mL,置于10 mL量瓶,甲醇定容,作為空白溶液。

      2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液、對照品溶液(0.1 mg/mL)及空白溶液各20 μL,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄色譜。結(jié)果顯示,VRB的出峰時間為7.9~8.1 min,空白溶液在此無色譜峰出現(xiàn),可見空白脂質(zhì)體對VRB的測定無干擾。理論板數(shù)按VRB峰計不低于3 000。

      2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣測定“2.2.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為y=2 068.1x+31 671(r=0.999 9,n=6),結(jié)果表明,VRB檢測質(zhì)量濃度在12.5~400 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

      2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,重復(fù)5次,計算峰面積的RSD為1.27%(n=5),表明該方法重復(fù)性良好。

      2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計算峰面積的RSD為1.62%(n=6),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取空白陽離子脂質(zhì)體1 mL,于10 mL量瓶,加0.1 mg/mL VRB對照品溶液1 mL,甲醇定容制成質(zhì)控樣品溶液,重復(fù)6次,進(jìn)樣測定,記錄峰面積,計算平均加樣回收率為99.00%(RSD為1.10%,n=6)。

      2.3 包封率的測定

      取Sephadex G-50 2.0 g,于PBS中浸泡24 h,濕法裝柱(10 cm×1.5 cm)備用。取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體0.5 mL,置于凝膠柱上方,以1.0 mL/min流速用PBS洗脫,收集乳光部分加PBS定容混勻。取WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體0.5 mL,加PBS定容至相同體積混勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,重復(fù)3次,計算包封率(%)=(W后/W前)×100%,式中W后和W前分別為過柱后和過柱前脂質(zhì)體中VRB的含量。

      2.4 優(yōu)化脂質(zhì)體處方

      根據(jù)單因素考察結(jié)果和文獻(xiàn)[10],依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法設(shè)計原理選擇對陽離子脂質(zhì)體包封率影響較大的3個因素即DC-Chol用量(X1)、膽固醇用量(X2)、VRB用量(X3)為因素,以包封率(Y)為指標(biāo),固定處方量為5 mL、磷脂為22 mg,確定各因素的用量范圍為:X1 4~12 mg,X2 4~12 mg,X3 0.2~0.6 mg,并分別設(shè)立3個水平設(shè)計試驗(yàn)。因素與水平見表1,星點(diǎn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

      將表2中數(shù)據(jù)輸入Design-Expert 8.0.6.1軟件,擬合方程為Y=21.320 0-2.266 9X1+18.973 8X2-178.037 5X3+0.426 6X1X2+1.118 8X1X3+10.475 0X2X3-0.131 9X12-1.178 4X22+62.250 0X32(R=0.970 3,P<0.05),說明模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化,可用于分析和預(yù)測WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體的最優(yōu)處方。對上述擬合模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果顯示,X2和X22對Y有顯著影響(P<0.01);X1、X3、X1X2、X2X3、X1X3對Y沒有顯著影響(P>0.05)。固定一個因素的水平為0,使用Design-Expert 8.0.6.1軟件生成其他因素對包封率的響應(yīng)面圖和等高線圖,響應(yīng)面圖見圖1,等高線圖見圖2。

      從圖1和圖2可以看出,3個因素間沒有明顯的交互作用,在磷脂固定不變的情況下X1和X3對Y的影響不大,但X2對Y有顯著影響。因此結(jié)合實(shí)驗(yàn)室脂質(zhì)體處方考察經(jīng)驗(yàn)及脂質(zhì)體制備的實(shí)際要求和脂質(zhì)體性狀,確定最優(yōu)處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg,處方量為5 mL。根據(jù)最優(yōu)處方制備3批WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體,測定包封率。結(jié)果顯示,3批樣品的包封率為(92.24±1.21)%,其與預(yù)測值(87.56%)的相對誤差為5.3%。表明該處方合理,方法可行。

      2.5 脂質(zhì)體中VRB的含量比較

      2.5.1 脂質(zhì)體的制備 按最優(yōu)處方,根據(jù)“2.1”項(xiàng)下方法制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體,同法制備,不含DC- Chol和WGA的VRB脂質(zhì)體。

      2.5.2 VRB的含量測定 分別測定WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體中VRB的含量,各3批。結(jié)果顯示,WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體中VRB的含量分別為(93.39±1.59)、(96.01±3.26) μg/mL(n=3)。

      2.6 脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

      2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%FBS、100 ?g/mL青-鏈霉素)培養(yǎng)液中,于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

      2.6.2 細(xì)胞存活率的測定 收集對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞(約2×104個/孔)接種于96孔培養(yǎng)板中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入0(空白對照)、0.011、0.027、0.043、0.059、0.076、0.092、0.110 ?g/mL WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體或VRB脂質(zhì)體,以空白陽離子脂質(zhì)體為對照,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用SRB法[11]測定細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=藥物處理后的光密度值/空白對照的光密度值×100%。結(jié)果顯示,與空白陽離子脂質(zhì)體和VRB脂質(zhì)體比較,WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體作用后細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)。3種脂質(zhì)體作用后MCF-7、A549細(xì)胞存活率結(jié)果見圖3。

      3 討論

      星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法是目前常用的將數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)相融合的試驗(yàn)設(shè)計方法,將星點(diǎn)設(shè)計應(yīng)用于脂質(zhì)體處方優(yōu)選的研究也不斷增多。脂質(zhì)體研究中常常將膜材用量比例作為研究指標(biāo),本試驗(yàn)在傳統(tǒng)脂質(zhì)體處方基礎(chǔ)上,固定磷脂量,以膽固醇、DC-Chol、VRB用量為因素,脂質(zhì)體包封率為指標(biāo)優(yōu)化了脂質(zhì)體處方,最終確定制備WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體(5 mL)的最優(yōu)處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg。2015年版《中國藥典》有關(guān)脂質(zhì)體包封率的要求為80%以上[12],經(jīng)驗(yàn)證該陽離子脂質(zhì)體最終處方的平均包封率為(92.24±1.21)%(n=3)。結(jié)果表明,該陽離子脂質(zhì)體處方符合要求,并為該陽離子脂質(zhì)體的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

      VRB對腫瘤有較好的臨床治療效果,因毒副作用大,常將其制備成靶向制劑。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇組成的類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),因其具有可與細(xì)胞膜融合、體內(nèi)可降解的特點(diǎn)被廣泛用于靶向給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體作為一種安全穩(wěn)定的載體形式,多用于基因靶向治療的研究中[13]。本課題在此基礎(chǔ)上引入陽離子材料,利用藥物與細(xì)胞膜表面負(fù)電荷的靜電吸附作用,增加其靶向性效果[14]。WGA可與腫瘤細(xì)胞表面的特定受體相結(jié)合,因此引入WGA修飾于脂質(zhì)體表面。最終制備了理論上具有雙重靶向治療作用的WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體。通過細(xì)胞存活率的比較,評價了VRB脂質(zhì)體和WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對MCF-7、A549細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示,WGA-VRB陽離子脂質(zhì)體對MCF-7、A549細(xì)胞存活的抑制作用強(qiáng)于VRB脂質(zhì)體。

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      (收稿日期:2017-08-29 修回日期:2017-11-09)

      (編輯:鄒麗娟)

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