茍　青，陶　玲，李曉莉，宋超峰，彭　亮，代梨梨，李　谷

(1.上海海洋大學海洋科學學院，上海 201306；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

胞外酶(extracellular enzyme)是指細胞內合成穿過細胞膜并在細胞外發(fā)揮作用，使多糖、蛋白質和脂質等高聚物裂解變?yōu)榭纱┻^細胞質膜而被吸收利用的小分子物質的一類酶[1]。水體中的溶解有機碳大多以高聚物的形式存在，不能被細菌等異養(yǎng)微生物直接利用，只有通過胞外酶的水解作用，把這些高聚物分解為小分子單體或低聚物才能被微生物利用[2]。這一關鍵的生化過程，改變了有機物的組成和可利用性，是調節(jié)水體有機營養(yǎng)平衡的重要生態(tài)因子，也是眾多異養(yǎng)微生物賴以生存的基礎。因此，水中胞外酶活性不僅可以反映水環(huán)境中有機物的數(shù)量和質量，還能反映浮游生物對有機組分的改造程度及該有機物組分對浮游生物生長繁殖的營養(yǎng)貢獻[3]。水環(huán)境中的胞外酶進行著物質的轉化和元素的循環(huán)，并促使能量的流動，調控著整個水生態(tài)系統(tǒng)的結構與功能。另外，胞外酶活性的變化及其分布特征可反映微生物活性及水環(huán)境營養(yǎng)狀況。Kiersztyn等[4]提出了酶TSI指標來評價水環(huán)境的營養(yǎng)狀況，并證明該指標在水體質量監(jiān)測中非常有效。

水中胞外酶活性特征指標還可以早期預警水環(huán)境脅迫[5]。養(yǎng)蝦池塘水中低蛋白酶活性與高生產力相關，水中高水平的蛋白酶活性和幾丁質酶活性指示水質惡化和環(huán)境脅迫[6]。但目前對淡水養(yǎng)殖池塘水中胞外酶活性特征的研究還鮮見報道。本研究運用熒光模擬底物法對養(yǎng)殖池塘水體中的堿性磷酸酶(AP)、β-葡萄糖苷酶(BG)、亮氨酸氨肽酶(LAP)以及脂肪酶(LIP)活性隨養(yǎng)殖進程的動態(tài)變化進行監(jiān)測，分析精養(yǎng)池塘水中胞外酶活性在不同粒徑生物上的分布，并研究池塘水中各酶活性與水質理化因子之間的相關性，以全面了解養(yǎng)殖池塘中物質循環(huán)以及評估養(yǎng)殖水體環(huán)境質量和生態(tài)效率，為池塘水質監(jiān)測和調控提供基礎性資料和科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗地點

實驗在中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣實驗基地進行。實驗在4口大小完全一樣的養(yǎng)殖池塘中進行，池塘面積667 m2，水深1.5 m。池塘主養(yǎng)草魚，放養(yǎng)規(guī)格100 g/尾，平均放養(yǎng)密度為1 000尾/667 m2，配養(yǎng)鰱規(guī)格為300 g/尾，鳙規(guī)格為150 g/尾。

1.2　采集與分析

1.2.1水質指標

1.2.2胞外酶活性

同時采集水樣裝入滅菌玻璃瓶用于酶活性測定，水樣分別用3 μm和0.22 μm的濾膜逐級過濾，以區(qū)分不同粒徑來源的胞外酶活性，將胞外酶的來源分為：>3 μm粒徑浮游生物酶活性，0.22～3 μm粒徑浮游生物酶活性，<0.22 μm的浮游生物酶活性。

酶活性的測定采用熒光模擬底物法(FMS)[8]，向待測水樣中加入相應的酶底物，在模擬現(xiàn)場溫度，避光條件下與酶反應3 h，在反應結束后加入HgCl2阻止反應，并迅速冷凍保存，空白樣在取水樣后直接加入HgCl2阻止反應，冷凍保存。測試前逐步解凍恢復至室溫，用熒光分光光度計測定樣品熒光強度。β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶和脂肪酶使用4-甲基傘形酮(MUF)為底物，反應生成4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷、4-甲基傘形酮酰磷酸酯和4-甲基傘形酮油酸酯，MUF的激發(fā)和發(fā)射波長分別是365 nm和455 nm。亮氨酸氨肽酶使用7-氨基-4甲基香豆素(AMC)為底物，反應生成L-亮氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素鹽酸鹽，AMC的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是380 nm和440 nm。以酶水解底物釋放出顯色熒光團(MUF或AMC)的速率來表示胞外酶活性。

1.2.3細菌總數(shù)

細菌總數(shù)采用平板涂布計數(shù)法，將處理好的水樣進行稀釋，分別取合適稀釋度的0.1 mL稀釋液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，計數(shù)。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

胞外酶活性與環(huán)境因子的相關分析在SPSS 20.0中進行，用Pearson 檢驗方法(檢驗水平為P<0.05和P<0.01)檢驗數(shù)據(jù)間的相關水平，主成分分析用Canoco for windows 4.5完成，用Origin 2015軟件繪圖。

2　結果與分析

2.1　池塘水質理化因子動態(tài)變化特征

池塘水體的理化指標如圖1所示。整個實驗期間，池塘水溫平均值為25.7 ℃，水溫的變化與氣溫保持一致，8月份最高為31.9 ℃，10月份最低為18.5 ℃。pH的變化范圍是6.8～8.1，且各月份的差異不大。DO隨著時間的變化先下降，在8月份的時候降到最低，后期略微上升。池塘水體透明度前期5-8月較高，后期9-10月份較低。

圖1　池塘水質理化因子的季節(jié)變化Fig.1　Seasonal variation of physicochemical parameters in ponds

2.2　池塘水中胞外酶活性動態(tài)變化特征

由圖2可以看出，池塘水中胞外酶活性均較高，總β-葡萄糖苷酶活性變化范圍為0.18～1.63 μmol/(L·h)，總堿性磷酸酶活性變化范圍為0.96～3.49 μmol /(L·h)，總脂肪酶活性變化范圍為1.48～2.68 μmol/(L·h)，總亮氨酸氨肽酶活性變化范圍為0.28～1.66μmol/(L·h)?？偊?葡萄糖苷酶活性隨著養(yǎng)殖時間的延長而升高，在8月份達到最高值(1.63 μmol/(L·h))后9月份下降，在10月份又升高至1.63 μmol/(L·h)?？倝A性磷酸酶的活性在實驗開始時處于較高水平，隨后下降再上升，在8月份達到另一個小高峰(3.5 μmol/(L·h))，之后則開始下降?？傊久富钚宰兓厔菖c堿性磷酸酶一致，先下降再升高再下降，不同的是，最低點(1.61 μmol/(L·h))出現(xiàn)在7月份，再次升高的最高點(2.15 μmol/(L·h))在9月份，但是比5月份(2.68 μmol/(L·h))的酶活性低?？偭涟彼岚彪拿富钚栽?-9月呈逐漸增加的趨勢(從0.29 μmol/(L·h)到1.69 μmol/(L·h))，10月份有所下降(0.93 μmol/(L·h))。

圖2　池塘水中胞外酶的動態(tài)變化Fig.2　Dynamics of extracellular enzymes in the pond water

為研究池塘水中胞外酶活性動態(tài)變化特點，對胞外酶數(shù)據(jù)進行標準化變換后，應用Canoco for Windows 4.5實施主成分分析。提取了4個主成分，主成分1(PC1)為65.3%，主成分2(PC2)為20.6%，前兩軸的累積貢獻率為85.9%。從排序圖可以看出，池塘水體胞外酶的月份變化比較明顯，各月份的胞外酶活性在排序圖上很好地分離開來。5月份各樣點分布于第一象限，6月份和7月份位于第四象限，8月份位于第二象限，9月份和10月份位于第三象限。

2.3　不同粒徑胞外酶活性分布

本研究中β-葡萄糖苷酶在養(yǎng)殖水體中的分配比例最高的是>3 μm粒徑浮游生物，其所占比例為70%～78%，其次為<0.22 μm的游離態(tài)，且隨著溫度的升高，游離態(tài)所占的比例增加，最高可達到51%。堿性磷酸酶活性主要來源為<0.22 μm的游離態(tài)，平均比例占到57.13%，其中，7月高溫季節(jié)，游離態(tài)堿性磷酸酶活性占絕對優(yōu)勢，達到79%。脂肪酶活性主要來源于<0.22 μm的游離態(tài)和>3 μm粒徑浮游生物，但不同月份在不同粒徑上的分布有所差別，6-10月，>3 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性呈逐漸升高趨勢。>3 μm粒徑浮游生物來源的亮氨酸氨肽酶活性始終處于優(yōu)勢地位，占75.04%～95.37%，其次是0.22～3 μm粒徑來源的亮氨酸氨肽酶占3.96%～12.3%，游離態(tài)的亮氨酸氨肽酶比例最低，而且隨著養(yǎng)殖時間的增加，游離態(tài)亮氨酸氨肽酶活性越低。

圖3　池塘水中胞外酶活性的主成分分析Fig.3　Principal component analysis of extracellular enzyme activities in the pond water

圖4　池塘中不同來源胞外酶活性的百分比圖Fig.4　Percentage of extracellular enzyme activities at various carriers in ponds

2.4　水中胞外酶活性與環(huán)境因子的關系

3　討論

表1　池塘水中胞外酶活性與水質理化因子的相關性分析Tab.1　Relationship of extracellular enzyme activities and water physical-chemical parameters

注：*表示在0.05水平上顯著相關；**表示在0.01水平上顯著相關

淡水養(yǎng)殖池塘中，堿性磷酸酶水解是磷轉化再生的重要機制[17]。堿性磷酸酶能夠酶促磷酸酯水解而釋放出磷酸根，將有機磷水解為無機磷，多具有外部功能，其主要作用是向細胞提供磷營養(yǎng)，它的合成有賴于環(huán)境中磷的營養(yǎng)狀態(tài)，與水體的磷循環(huán)和碳循環(huán)密切相關[18]。本研究中<0.22 μm的游離態(tài)為堿性磷酸酶主要的來源(57.13%)，在廈門西海域[19]的研究也有相似的結果。海水中81.2% 堿性磷酸酶活性來自于<0.22 μm粒徑的游離態(tài)[15]。在法國海灣的研究[20]中發(fā)現(xiàn)，堿性磷酸酶的主要來源為0.22～3 μm粒徑(60%)，與本研究有所差異，可能原因是養(yǎng)魚對水體的溶解態(tài)堿性磷酸酶有重要貢獻[21]，養(yǎng)殖飼料的輸入及魚的糞便增加了底質的酶活性，魚的活動擾動底質，從而增加了池塘的自由態(tài)的堿性磷酸酶活性。另外一個可能的原因是細胞裂解產生的游離態(tài)堿性磷酸酶在水體中持久時間更長[22]。

脂肪酶是一種較小的蛋白質，是參與脂質降解最典型的酶，能夠將脂肪水解為甘油和脂肪酸，在脂質轉化過程中起到主要作用。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，脂肪占所有有機物的 3%～55%?；畹幕蛩劳龅母∮沃参?、浮游動物和大型植物是水體脂肪的主要來源[23]。養(yǎng)殖池塘水中殘餌含有較高的脂肪，這可能是本研究中池塘水中具有較高脂肪酶活性的原因，其最高可達到2.68 μmol/(L·h)。Gajewski[24]在多瑙河的研究中發(fā)現(xiàn)<0.2 μm粒徑來源的游離態(tài)脂肪酶活性占總脂肪酶活性的20.1%～56.3%，0.2～1 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性占21.2%～36%，>1 μm粒徑浮游生物來源的脂肪酶活性占18.2%～58.8%。本研究中脂肪酶的形態(tài)主要為游離態(tài)和>3 μm粒徑浮游生物來源(分別為40.78%和40.04%)，這可能跟不同水體脂肪來源不同有關，養(yǎng)殖池塘水中細胞裂解形成的游離態(tài)酶及浮游植物和大顆粒附著態(tài)細菌來源的脂肪酶占主導，這可能與本研究池塘中浮游植物具有較高的生物量相關(Chl.a含量為264.6 mg/m3)。同時，浮游植物死亡之后，脂肪的濃度較高[24]，實驗中發(fā)現(xiàn)5-9月池塘中浮游植物裂解在水面形成脂質油膜，可能增加水中游離態(tài)脂肪酶的活性。

亮氨酸氨肽酶能從N端依次水解L型氨基酸組成的肽和酰肽，將多肽分解為亮氨酸和其他疏水性的氨基酸，從而為異養(yǎng)細菌的生長提供所需的氮源物質，在水環(huán)境中氮元素的生物地球化學循環(huán)過程中起著非常重要的作用[25]。水體中的肽酶很大程度上依賴于水體中多肽的濃度，當水體中的蛋白質明顯增加時，亮氨酸氨肽酶會迅速的合成[26]。Patel 等[27]報道亮氨酸氨肽酶活性隨著富營養(yǎng)化程度提高而提高，這解釋了本研究中隨著養(yǎng)殖進程池塘水中氮磷等營養(yǎng)水平提高，亮氨酸氨肽酶活性也呈提高的趨勢。Konopka等[2]的研究發(fā)現(xiàn)87%的氨肽酶是附著態(tài)的。法國Aydat湖的研究[28]也表明，大于1 μm的亮氨酸氨肽酶活性占總的亮氨酸氨肽酶酶活性的75.4%，0.2～1 μm的占12.1%，小于0.2 μm的游離態(tài)占12.4%，與本研究的結果一致，大于3 μm粒徑浮游生物來源的亮氨酸氨肽酶活性比例最高，占75.04%～95.37%。浮游植物同化形成的蛋白質能調控亮氨酸氨肽酶活性，本研究中亮氨酸氨肽酶活性與葉綠素濃度呈正相關，表明養(yǎng)殖池塘中浮游植物也能對亮氨酸氨肽酶活性進行調控。另外，亮氨酸氨肽酶活性與DO負相關，與其他水質因子正相關，說明含氮有機物的分解需要消耗大量氧氣，亮氨酸氨肽酶活性越高，分解作用越強，導致的池塘DO水平降低，這可能是亮氨酸氨肽酶活性越高，養(yǎng)殖生產力越低[6]的原因。養(yǎng)殖過程中亮氨酸氨肽酶活性在10月份以前呈逐漸上升趨勢，提示了養(yǎng)殖水質有惡化傾向。因此，養(yǎng)殖過程中更應該關注亮氨酸氨肽酶活性。通過亮氨酸氨肽酶活性監(jiān)測淡水養(yǎng)殖池塘水質進行早期預警，具可行性。

酶的種類和活性水平的變化反映了環(huán)境的營養(yǎng)狀態(tài)，浮游細菌可以通過優(yōu)勢種類的變化和相同種類浮游細菌相關酶基因表達量的變化來應對環(huán)境中有機物濃度和成分變化[29]。胞外酶活性在較短時間內具有動態(tài)變化幅度大的特點，可反映浮游細菌種類和環(huán)境因子的動態(tài)變化。因此，本研究通過弄清養(yǎng)殖過程中胞外酶活性動態(tài)特征，在養(yǎng)殖生產中可針對池塘水中胞外酶活性動態(tài)(特別是亮氨酸氨肽酶活性)調整管理措施，及時調節(jié)水體有機營養(yǎng)平衡。另外，水解酶的活性受到底物種類和濃度的影響，本研究中未測定池塘水中顆粒態(tài)和溶解態(tài)有機物的濃度，下一步研究中應當同時監(jiān)測池塘水中有機物種類和濃度，結合胞外酶活性動態(tài)，以全面了解池塘生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)。