趙 晶 蔣麗霞 董冰冰

（上海其勝生物制劑有限公司，上海 201106）

近年來(lái)，多糖類(lèi)凝膠的研究熱點(diǎn)集中在透明質(zhì)酸鈉、幾丁糖等，二者臨床應(yīng)用廣泛。目前市場(chǎng)上多糖類(lèi)凝膠多采用預(yù)灌封注射器（玻璃注射器+橡膠錐頭帽、膠塞）或西林瓶聯(lián)合丁基橡膠灌裝，必須達(dá)到無(wú)菌要求。法規(guī)對(duì)三類(lèi)醫(yī)療器械的要求逐漸提高，2015年《中國(guó)藥典》滅菌法規(guī)定只要物品允許，應(yīng)盡可能選用最終滅菌法滅菌，所以未來(lái)無(wú)菌產(chǎn)品的滅菌趨勢(shì)仍是終端滅菌。醫(yī)療器械常用的終端滅菌方法主要有干熱、濕熱、環(huán)氧乙烷（EO）、電離γ或β輻射[1]。這些方法通過(guò)物理或化學(xué)方式對(duì)細(xì)菌起到殺滅的效果，但在滅菌的同時(shí)可能導(dǎo)致這些生物高分子結(jié)構(gòu)的不可逆變化，并最終影響產(chǎn)品的功能。

現(xiàn)今對(duì)于多糖類(lèi)凝膠滅菌方式的研究報(bào)道較少。其中San Juan研究了幾丁糖凝膠的γ輻射滅菌，研究結(jié)果表明劑量為15 kGy時(shí)可使幾丁糖凝膠分子量降低80%[2]，而透明質(zhì)酸鈉凝膠終端滅菌多集中在濕熱滅菌法。由此可見(jiàn)目前還沒(méi)有關(guān)于多糖類(lèi)凝膠滅菌方式的系統(tǒng)研究，為此采用三種常規(guī)滅菌方式考察其對(duì)多糖類(lèi)凝膠產(chǎn)品性能的影響，為該類(lèi)產(chǎn)品的終端滅菌方式探索提供一定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料：幾丁糖凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）、透明質(zhì)酸鈉凝膠（上海其勝生物制劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 濕熱滅菌：取上述幾丁糖凝膠、透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品適量，取10支2.0×106孢子數(shù)/單位蒸汽滅菌生物指示劑（ATCC 7953；ACE test）裝在空注射器內(nèi)，分別按照121 ℃、F0=8.0和F0=9.0參數(shù)進(jìn)行濕熱滅菌。滅菌后，培養(yǎng)生物指示劑，觀察指示劑顏色變化。將試驗(yàn)組和對(duì)照組分別檢測(cè)重均分子量。

1.2.2 環(huán)氧乙烷（EO）滅菌：本滅菌法主要考察滅菌的有效性和環(huán)氧乙烷的殘留量。

取上述幾丁糖凝膠、透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品適量，環(huán)氧乙烷滅菌參數(shù)分別選擇48 ℃滅菌18 h、54 ℃滅菌18 h；同時(shí)將10支EO滅菌生物指示劑置于空注射器內(nèi)，另將10支1.5×106孢子數(shù)/單位EO滅菌生物指示劑（ATCC9372；ACE test）置于注射器外泡罩內(nèi)，作為滅菌效果對(duì)照。滅菌后，培養(yǎng)生物指示劑，觀察指示劑顏色變化，檢測(cè)滅菌后重均分子量，檢測(cè)滅菌后初始、解析14 d、解析44 d環(huán)氧乙烷殘留量。

1.2.360Co-γ射線(xiàn)輻射滅菌：本滅菌法主要考察滅菌的有效性和樣品的外觀變化。根據(jù)ISO11137.2-2013 Sterilization of health care products-Radiation-Part 2:Establishing the sterilization dose選擇60Co-γ輻射滅菌最低劑量3 kGy（平均生物負(fù)載=1.0時(shí)達(dá)到SAL=10-2所需的輻照劑量）和常用的輻射滅菌吸收劑量25 kGy。生物指示菌分別采用102孢子數(shù)/單位和106孢子數(shù)/單位的金黃色葡萄球菌放置在空注射器內(nèi)。

取上述幾丁糖凝膠、透明質(zhì)酸鈉凝膠樣品適量，按照產(chǎn)品包裝方式包裝分別進(jìn)行既定參數(shù)輻射滅菌。滅菌結(jié)束后，檢查樣品外觀，檢測(cè)重均分子量和生物指示菌的情況。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 重均分子量：將色譜柱通過(guò)激光散射儀與示差檢測(cè)器雙機(jī)連接，用0.1 mol/L的硝酸鈉-0.2‰疊氮化鈉溶液流動(dòng)相清洗后的進(jìn)樣器抽取用流動(dòng)相稀釋的樣品，通過(guò)進(jìn)樣環(huán)進(jìn)樣，在規(guī)定的流速下檢測(cè)樣品的分子量。

1.3.2 環(huán)氧乙烷殘留量[3]

1.3.2.1 色譜條件：采用GC7890A氣相色譜儀Agilent J&W DB-624柱，柱溫：50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速率升至120 ℃，后運(yùn)行160 ℃。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，檢測(cè)器溫度：250 ℃。G1888 A頂空進(jìn)樣器，進(jìn)樣器爐溫60 ℃；定量環(huán)溫度70 ℃；傳輸線(xiàn)溫度80 ℃。樣品平衡時(shí)間：40 min。

1.3.2.2 樣品處理。錐頭帽：對(duì)解析完成后的樣品進(jìn)行取樣，將樣品剪為5 mm長(zhǎng)左右的碎塊（或10 mm2片狀物），稱(chēng)取1.0 g放入20 mL頂空瓶中，精密加入10 mL水，密封萃取。

環(huán)氧乙烷殘留量：將1支幾丁糖凝膠樣品完全擠出至20 mL頂空瓶中，精密加入10 mL水，密封萃取。

1.3.2.3 檢測(cè)：采用外標(biāo)定量法檢測(cè)，頂空進(jìn)樣，待環(huán)氧乙烷色譜峰流出后，記錄環(huán)氧乙烷峰的面積值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和供試液相應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕熱滅菌：兩種濕熱滅菌條件下，生物指示劑經(jīng)培養(yǎng)后呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照生物指示劑正常生長(zhǎng)，滅菌效果有效；幾丁糖凝膠重均分子量下降幅度較大，跌幅均在20%以上；透明質(zhì)酸鈉凝膠重均分子量相對(duì)較小，在15%～20%（表1）?？梢?jiàn)，濕熱滅菌對(duì)多糖類(lèi)凝膠的重均分子量影響不同。

表1 三種終端滅菌方式對(duì)多糖類(lèi)凝膠重均分子量的影響

2.2 環(huán)氧乙烷滅菌：兩種環(huán)氧乙烷滅菌參數(shù)下，泡罩內(nèi)的生物指示劑經(jīng)培養(yǎng)后均呈陰性，注射器內(nèi)的生物指示劑經(jīng)培養(yǎng)后均呈陽(yáng)性，陽(yáng)性對(duì)照指示菌正常生長(zhǎng)，說(shuō)明環(huán)氧乙烷氣體未能全部進(jìn)入注射器內(nèi)，不能有效地達(dá)到終端滅菌的效果。滅菌后凝膠含有大量的EO殘留，經(jīng)過(guò)44 d解析后，48 ℃18 h滅菌樣品EO殘留在12 μg/支左右，54 ℃ 18 h滅菌樣品EO殘留則在22 μg/支左右（圖1）。

2.360Co-γ射線(xiàn)輻射滅菌：生物指示菌完全殺滅，滅菌有效；3 kGy輻射后的注射器呈淺棕色，25 kGy輻射后的注射器呈深棕色，可見(jiàn)60Co-γ射線(xiàn)輻射嚴(yán)重影響注射器的顏色。滅菌前后凝膠的外觀變化顯著，幾丁糖凝膠由液體凝膠狀變成半固體凝膠，透明質(zhì)酸鈉凝膠由液體凝膠變成稀溶液，同時(shí)，二者重均分子量均出現(xiàn)顯著降低，幾丁糖降低50%以上，透明質(zhì)酸鈉降低99%以上（表1）。顯然這種滅菌方式也不適合注射器類(lèi)多糖凝膠的終端滅菌。

圖1 EO滅菌樣品環(huán)氧乙烷殘留量檢測(cè)結(jié)果（μg/支）

3 討 論

濕熱滅菌的參數(shù)選擇主要依據(jù)物品本身的熱穩(wěn)定性和初始污染菌數(shù)量，由于多糖類(lèi)凝膠的生產(chǎn)環(huán)境均是過(guò)程無(wú)菌，初始污染菌不得檢出，濕熱滅菌提高無(wú)菌保證水平達(dá)到10-6。因此對(duì)于多糖類(lèi)凝膠濕熱滅菌的選擇主要取決于該物品的熱穩(wěn)定性。幾丁糖凝膠屬于天然可降解的多糖產(chǎn)品，其穩(wěn)定性比較差，采用濕熱滅菌作為最終滅菌方式時(shí)，高溫加熱可使幾丁糖降解[4]，重均分子量驟降。2015年版中國(guó)藥典滅菌法規(guī)定對(duì)于熱不穩(wěn)定性物品的F0值一般不低于8 min。本研究即使采用最低滅菌時(shí)間121 ℃ F0=8.0，幾丁糖滅菌后的重均分子量降低20%以上，且動(dòng)力黏度與重均分子量存在一定的正相關(guān)性，重均分子量的降低，勢(shì)必影響凝膠重要的性能動(dòng)力黏度的降低。而透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)濕熱滅菌，重均分子量的降低較小，可保證產(chǎn)品沒(méi)有發(fā)生較大的熱降解，能達(dá)到臨床應(yīng)用的要求。說(shuō)明濕熱滅菌的選擇依賴(lài)于產(chǎn)品本身的熱穩(wěn)定性，以及臨床需求。因此，多糖類(lèi)凝膠可以根據(jù)產(chǎn)品本身的性質(zhì)以及臨床需要選擇濕熱滅菌方式進(jìn)行終端滅菌。

采用EO滅菌，預(yù)灌封注射器的玻璃材質(zhì)EO無(wú)法穿透，EO只能通過(guò)橡膠材質(zhì)的錐頭帽和膠塞進(jìn)入制品，穿透性差，注射器內(nèi)產(chǎn)品殺滅值達(dá)不到SAL≤10-6，滅菌效果不理想；而且橡膠制品材質(zhì)易吸附EO氣體，滅菌后凝膠內(nèi)存在大量的EO殘留，按照貯存要求在2～8 ℃條件下存放44 d后，凝膠仍有較多殘留，解析緩慢，超過(guò)GBT 16886.7-2001醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第7部分：環(huán)氧乙烷滅菌殘留量要求的安全標(biāo)準(zhǔn)（1.25 μg/支）。另外，多糖類(lèi)凝膠主要成分為有效成分和生理緩沖液，含水和氯離子，殘留EO易與水反應(yīng)生成次乙二醇（EG），與氯反應(yīng)生成2-氯乙醇（ECH），其中ECH屬中等毒性物質(zhì)，不易降解，具有致突變性，容易會(huì)造成急性中毒事故，特別是造成嚴(yán)重中樞神經(jīng)損傷和腦水腫[5]。據(jù)此分析，在產(chǎn)品貯存條件下，環(huán)氧乙烷的殘留量的下降并非是環(huán)氧乙烷真正從產(chǎn)品中解析出去，而是與產(chǎn)品中的氯離子和水發(fā)生化學(xué)反應(yīng)所致?？傮w來(lái)說(shuō)，環(huán)氧乙烷滅菌對(duì)于預(yù)灌封注射器產(chǎn)品的滅菌既存在不易穿透進(jìn)去達(dá)不到預(yù)期的滅菌效果，又存在進(jìn)入到注射器內(nèi)不易解析出來(lái)而產(chǎn)生臨床使用安全性的問(wèn)題。因此，考慮到滅菌的有效性和臨床使用的安全性，EO滅菌不適用于多糖類(lèi)凝膠的最終滅菌。

采用60Co-γ射線(xiàn)輻射滅菌，即使采用最低劑量3 kGy，依然導(dǎo)致注射器顏色發(fā)生顯著變化，凝膠的重均分子量下降50%以上。幾丁糖分子本身?yè)碛写罅康牧u基，60Co-γ的穿透性很強(qiáng)，在高劑量的γ輻射條件下，很容易介導(dǎo)幾丁糖中的氨基、羧基基團(tuán)間的交聯(lián)反應(yīng)，且這種交聯(lián)反應(yīng)大多發(fā)生在分子間，交聯(lián)后的幾丁糖凝膠空間網(wǎng)絡(luò)極為致密，致使產(chǎn)品由液體凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w凝膠，彈性提高，而黏性急劇下降，這也就改變了幾丁糖原來(lái)的分子結(jié)構(gòu)，失去了與預(yù)期用途相關(guān)的基本性質(zhì)。而透明質(zhì)酸鈉凝膠經(jīng)60Co-γ輻射滅菌變成液體，學(xué)術(shù)上尚未有相關(guān)報(bào)道，可能因?yàn)楦邉┝康摩幂椛鋵?dǎo)致主鏈斷裂，失去原有的凝膠性質(zhì)。顯然這種滅菌方式也不適合多糖凝膠的終端滅菌。

通過(guò)以上對(duì)產(chǎn)品理化性質(zhì)和滅菌方法的研究分析，環(huán)氧乙烷滅菌和輻照滅菌終端滅菌方式均不適用于多糖類(lèi)凝膠的終端滅菌，而濕熱滅菌的選擇則取決于多糖類(lèi)凝膠本身的性質(zhì)和臨床用途。