王 甜， 鄭雪婷， 齊文靜， 何 黎， 張文寶， 李琳琳， 李 軍

(新疆醫(yī)科大學1藥學院， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院， 烏魯木齊 830054)

包蟲病是呈全球性分布的一種人獸共患病，有兩種分型,分別是由細粒棘球絳蟲(E.granulosus, E.g)感染所致的囊型包蟲病(Cystis Echinococcosis, CE)和多房棘球絳蟲(E.multilocularis, E.m)感染所致的泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis, AE)。細粒棘球絳蟲寄生于人、家畜和嚙齒動物的肝、肺等實質(zhì)器官內(nèi)[1]，對人身體健康和畜牧經(jīng)濟造成嚴重影響[2]。實驗室研究用原頭蚴通常采集于自然感染綿羊或包蟲病患者病灶內(nèi)[3]，但受季節(jié)、畜牧屠宰量等各種因素限制。首先包蟲病呈現(xiàn)地理分布，主要分布在我國新疆和內(nèi)蒙古高原、青藏高原、陜甘中黃土高原等[4-5]，因此其它地區(qū)研究材料匱乏。其次，采集于不同地點、時間、季節(jié)等自然感染的羊肝，收集的原頭蚴總量及活力完全不同，因此在實驗室內(nèi)獲得原頭蚴，體外培養(yǎng)成微囊注射到小鼠體內(nèi)獲得原頭蚴，完成實驗室內(nèi)原頭蚴→原頭蚴的循環(huán)至關(guān)重要。本研究采用高感染率的腹腔注射微囊法感染BALB/c小鼠[6]，通過解剖不同感染時期小鼠，確定生長發(fā)育出細粒棘球絳蟲原頭蚴的可育囊時間，為今后包蟲病的生物學及醫(yī)學研究提供保障。

1 材料方法

1.1實驗動物雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。

1.2主要儀器與試劑離心機(Centrifuge 5424R型)購于德國eppendorf公司，酶標儀(MULTISKAN SPECTRUM型)和CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱(series 8000 DH型)購于Thermo公司，生物安全柜(HFsafe-1200B2型)購于中國Heal Force公司，D-Hank′s緩沖液(SH30031.02)、胎牛血清(SV30087.02)、磷酸緩沖鹽溶液、青/鏈霉素溶液(SV30010)、RPMI-1640培養(yǎng)基(SH30809.01)購于美國Hyclone公司，多聚甲醛(P6145)、胃蛋白酶(P7000)、亞甲基藍購于德國Sigma-Aldric公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒(23227)購于美國Thermo公司，羊抗鼠IgG購于美國BETHYL公司。

1.3細粒棘球絳蟲原頭蚴的制備及體外微囊的培養(yǎng)取自然感染的綿羊肝臟或肺臟，采集細粒棘球絳蟲原頭蚴。用1%胃蛋白酶(pH 2.0)37℃消化30 min，用含有雙抗的PBS在無菌條件下漂洗3～5遍后，亞甲基藍檢測活力>95%，用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，體外培養(yǎng)約2個月，即可獲得直徑約200～300 μm的細粒細粒棘球絳蟲微囊[6]。

1.4細粒棘球絳蟲微囊感染BALB/c小鼠將BALB/c小鼠80只，根據(jù)體質(zhì)量隨機分為正常飼養(yǎng)組(3、6、9、12個月)、細粒棘球絳蟲感染組(3、6、9、12個月)，感染組用無菌PBS(含1%雙抗)漂洗培養(yǎng)得到的細粒棘球絳蟲微囊3～5遍，以每只鼠35個微囊的量，采用腹腔注射的途徑接種于BALB/c小鼠體內(nèi)，建立細粒棘球絳蟲感染小鼠模型[6]。

1.5細粒棘球絳蟲感染小鼠處理

1.5.1 剖殺感染小鼠 分別在感染后第3、6、9、12個月稱重，采血，剖殺小鼠，觀察小鼠腹腔內(nèi)包囊生長情況，細查包囊寄生部位和包囊數(shù)量及外觀形態(tài)。取出包囊用PBS漂洗，用濾紙吸干囊外壁水分，刺破包囊，收集囊液，光學顯微鏡下觀察囊液沉淀物中是否有原頭蚴，并在光學顯微鏡下拍照、記錄原頭蚴狀態(tài)。

1.5.2 小鼠感染模型組織學鑒定 取完整包囊，PBS漂洗3～5次，用4%的多聚甲醛固定。包囊經(jīng)過伊紅預(yù)染色3 h、梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素—伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察包囊結(jié)構(gòu)，拍照測量包囊角質(zhì)層厚度。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清抗體變化 收集羊源細粒棘球絳蟲囊液，離心，濃縮上清。用BCA試劑盒測定羊囊液蛋白含量為1.2 mg/mL，以5 μg/mL孔的濃度包被到96 孔酶標板上，小鼠血清濃度1∶100，酶標物為羊抗鼠IgG，工作濃度為1∶5 000。底物顯色劑為ABTS，以樣品孔與陰性孔血清的光密度(OD 405 nm)比值大于3(P/N≥3)為陽性，反之為陰性[7]。

2 結(jié)果

2.1BALB/c小鼠繼發(fā)感染模型不同時間段解剖觀察在觀察感染細粒棘球絳蟲微囊不同時間段小鼠發(fā)現(xiàn)，感染早期小鼠體質(zhì)量、形態(tài)無明顯變化，但隨感染時間的增長小鼠腹部隆起愈加明顯，感染3個月、6個月、9個月小鼠體質(zhì)量與同批正常組小鼠體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計學意義，但感染12個月小鼠體質(zhì)量增長至(32.76±3.76) g，飼養(yǎng)12個月小鼠體質(zhì)量為(27.20±1.21) g，與正常組小鼠體質(zhì)量比較明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

解剖發(fā)現(xiàn)感染細粒棘球絳蟲微囊3個月的10只小鼠腹腔內(nèi)包囊數(shù)量不等，包囊多游離于腹腔，但有少量包囊鑲嵌于肝臟表面，10只小鼠共計196個包囊，包囊直徑為(3.25±1.44) mm。感染6、9個月小鼠腹腔內(nèi)包囊囊壁增厚增白，包囊直徑增大至(7.20±2.53) mm、(9.00±2.66) mm，但包囊總數(shù)減少至86個。感染細粒棘球絳蟲12個月的10只小鼠體內(nèi)的24個包囊直徑增大至(14.21±3.14) mm，見表1。

刺破包囊囊壁，并充分漂洗囊壁，在光學顯微鏡在觀察發(fā)現(xiàn)，感染細粒棘球絳蟲微囊3～9個月小鼠體內(nèi)包囊均未見原頭蚴，而感染細粒棘球絳蟲微囊12個月的小鼠體內(nèi)包囊有原頭蚴，原頭蚴活力良好(圖2)，且10只小鼠體內(nèi)的24個包囊均可見原頭蚴，共計43 000個原頭蚴。

注：與飼養(yǎng)12個月組比較, *P<0.05。

感染時間/月小鼠數(shù)量/只包囊直徑/mm共計包囊數(shù)/含原頭蚴包囊數(shù)/個原頭蚴量/個3103.25±1.44196/006107.20±2.53130/009109.00±2.6686/00121014.21±3.1424/2443 000

a：體外培養(yǎng)細粒棘球絳蟲微囊

b：小鼠細粒棘球絳蟲感染3個月模型體內(nèi)包囊

c：小鼠細粒棘球絳蟲感染12個月模型體內(nèi)包囊

d：小鼠12個月包囊沉淀物

圖2小鼠細粒棘球絳蟲繼發(fā)感染3個月、12個月小鼠體內(nèi)包囊和囊液沉淀物

分離感染不同時期小鼠體內(nèi)包囊，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、伊紅預(yù)染色、酒精脫水、石蠟包埋和HE染色，結(jié)果顯示，感染不同時期包囊生發(fā)層和角質(zhì)層染色均勻，但感染早期生發(fā)層著色較深，說明生發(fā)層生長較為活躍[8]。感染晚期生發(fā)層逐漸成熟，著色較淺。測量角質(zhì)層厚度發(fā)現(xiàn)感染6個月、9個月的包囊囊壁的角質(zhì)層厚度較感染3個月也表現(xiàn)出增厚，但差異無統(tǒng)計學意義。但感染12個月包囊角質(zhì)層厚度約為(713.41±91.08) μm，較感染3個月包囊囊壁角質(zhì)層厚度[(206.89±43.93) μm]明顯增厚，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3，提示包囊囊壁角質(zhì)層的厚度與產(chǎn)生原頭蚴有關(guān)。

2.2小鼠血清抗體的變化飼養(yǎng)3個月正常組小鼠血清OD值為(0.30±0.09)，感染細粒棘球絳蟲微囊3個月小鼠血清OD值為(1.19±0.13) (P/N≥3，為陽性)，與正常組比較抗體水平明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時感染12個月小鼠血清OD值為(1.51±0.41)，與同批正常小鼠血清OD值比較也明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

a：感染3個月小鼠包囊病灶LL角質(zhì)層(laminated layer); b：感染12個月小鼠包囊病灶GL生發(fā)層(germinal layer)

圖3小鼠細粒棘球絳蟲繼發(fā)感染模型包囊病灶的組織學觀察(100×)

羊囊液抗原檢測細粒棘球絳蟲微囊感染小鼠血清，血清中囊液抗原的抗體水平隨時間變化呈遞增的趨勢，表現(xiàn)出較強特異性，但感染3個月、6個月、9個月、12個月小鼠血清OD值差異無統(tǒng)計學意義，說明感染小鼠產(chǎn)生的抗體水平與產(chǎn)生原頭蚴無直接關(guān)系。

3 討論

Hui等[9]研究發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)包囊時間約為12個月，可見原頭蚴，但是原頭蚴數(shù)量較少，且需要耗費大量的人力物力[10]等，所以我們用體內(nèi)方法生產(chǎn)原頭蚴。本研究表明小鼠感染3個月到感染12個月體內(nèi)包囊直徑從(3.25±1.44) mm增大至(14.21±3.14) mm，包囊生長呈時間依賴性增長，但是比較感染3個月小鼠體內(nèi)直徑同樣為10 mm包囊和感染12個月直徑為10 mm包囊，刺破后發(fā)現(xiàn)感染3個月包囊囊液中無原頭蚴，而感染12個月小鼠體內(nèi)包囊可發(fā)育出原頭蚴，表明包囊是否發(fā)育出原頭蚴與包囊直徑大小無直接關(guān)系。同時發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)包囊總數(shù)隨著感染時間延長，包囊總數(shù)由感染3個月的196個減少到感染12個月的24個，說明包囊在小鼠體內(nèi)生長發(fā)育呈明顯競爭性，不可育包囊可能被機體侵蝕或自然死亡，可育包囊隨時間延長而發(fā)育原頭蚴。

注：與飼養(yǎng)3個月組比較,*P<0.05; 與飼養(yǎng)12個月組比較,△P<0.05。

圖4囊液抗原ELISA檢測細粒棘球絳蟲小鼠模型血清抗體

ELISA實驗發(fā)現(xiàn)感染3個月小鼠血清OD值為(1.19±0.13)，感染12個月小鼠血清OD值為(1.51±0.41)，呈陽性反應(yīng)。感染12個月小鼠血清OD值與感染3個月、6個月、9個月的小鼠血清OD值相比呈遞增趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。表明ELISA方法檢測感染小鼠血清(1∶100稀釋)抗體水平，可用來檢測細粒棘球絳蟲感染是否成功，不能作為小鼠體內(nèi)包囊的是否發(fā)育出原頭蚴的指標。

感染細粒棘球絳蟲微囊小鼠體內(nèi)包囊病理結(jié)果顯示，感染12個月模型小鼠，包囊囊壁明顯增厚、增白，包囊囊壁病理學檢查發(fā)現(xiàn)囊壁角質(zhì)層增厚至(713.41±91.08) μm，與感染3個月小鼠體內(nèi)包囊囊壁角質(zhì)層厚度相比，差異有統(tǒng)計學意義。很多研究也表明多房棘球絳蟲感染小鼠后3個月左右可在病灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)原頭蚴[11]，但在感染1～9個月細粒棘球絳蟲小鼠體內(nèi)包囊未見原頭蚴[6]，說明包囊囊壁角質(zhì)層厚度可能是包囊是否發(fā)育為可育囊重要指標。

前期研究發(fā)現(xiàn)感染細粒棘球絳蟲微囊56 w后，在BALB/c小鼠體內(nèi)一個直徑為31 mm的包囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)4個原頭蚴[7]。本研究在小鼠感染細粒棘球絳蟲微囊12個月(52 w)即可生產(chǎn)出43 000個原頭蚴，推測新疆株細粒棘球絳蟲原頭蚴與澳大利亞株細粒棘球絳蟲原頭蚴在BALB/c小鼠體內(nèi)存在明顯差別，而新疆株細粒棘球絳蟲原頭蚴在BALB/c小鼠體內(nèi)生長發(fā)育更快。有研究報道，通過腹腔注射15 000個新疆株原頭蚴感染子午砂土鼠，在357 d發(fā)現(xiàn)8只小鼠中有7只小鼠體內(nèi)包囊可發(fā)育出原頭蚴[12]，而在本研究中通過腹腔注射35個細粒棘球絳蟲微囊，感染12個月的10只BALB/c小鼠體內(nèi)均可見原頭蚴。推測可能新疆株細粒棘球絳蟲微囊在BALB/c小鼠體內(nèi)生長更為穩(wěn)定，并發(fā)育良好。

本研究結(jié)合細粒棘球絳蟲體外培養(yǎng)和小鼠體內(nèi)感染完成原頭蚴→原頭蚴的實驗室循環(huán)，并用感染細粒棘球絳蟲小鼠生產(chǎn)出原頭蚴，不僅為后期細粒棘球絳蟲原頭蚴取材提供一個時間借鑒，還可維持穩(wěn)定實驗室研究用原頭蚴，最終為后期研究細粒棘球絳蟲的克隆奠定基礎(chǔ)。