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      米曲霉基因組與酶系表達研究進展

      2018-07-18 09:40:02周斌王靜周其洋童星
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年6期
      關(guān)鍵詞:肽酶水解酶糖類

      周斌,王靜,周其洋,童星

      (佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山,528500)

      米曲霉在東方傳統(tǒng)釀造食品中的應用已經(jīng)有上千年歷史,是中國及日本醬油等發(fā)酵產(chǎn)品的主要生產(chǎn)菌株,其安全性已經(jīng)得到美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)[1-2]和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)[3]的認可。在這些食品發(fā)酵過程中,米曲霉能夠分泌大量的蛋白水解酶和糖類水解酶,并將大豆和小麥等原料降解成短肽、氨基酸、寡糖及單糖,這些小分子物質(zhì)是提供產(chǎn)品風味的源泉。在中國,醬油釀造一般使用米曲霉滬釀3.042[4];而日本則多采用米曲霉和醬油曲霉混合菌種發(fā)酵。日本龜甲萬中央研究院研究表明,日本釀造企業(yè)使用菌種中有74%是兩種以上的菌株混合,同時菌株種類79%為米曲霉,21%為醬油曲霉[5]。為獲得性狀優(yōu)良的菌株,菌種的選育和持續(xù)改良貫穿于整個發(fā)酵過程,是現(xiàn)代發(fā)酵菌種技術(shù)的核心內(nèi)容。但目前傳統(tǒng)釀造行業(yè)中米曲霉菌株的研究大部分還停留在表觀研究階段,即通過最終酶活力來表觀菌株的發(fā)酵性能,對于酶活力究竟是怎么來的,如何分泌,有哪些基因調(diào)控,很少有人去深究。我們希望通過綜述米曲霉基因組,以及基因與酶系蛋白表達之間的關(guān)系,使人們能夠更加深入地了解米曲霉基因組和酶系基因的組成特點及作用機制,為將米曲霉更好地應用于傳統(tǒng)釀造食品提供指導。

      1 米曲霉基因組研究現(xiàn)狀

      NCBI數(shù)據(jù)庫中將基因組組裝完整度由好到差依次分為Complete、Chromosome、Scaffold及Contig四個等級。2017 年11 月 10日在NCBI中對真菌(Fungi)基因組進行檢索分析,發(fā)現(xiàn)達到4種組裝水平的基因組數(shù)量為2 672條,曲霉屬有91條,僅占真菌總量的3.4%。沒有曲霉屬菌株基因組組裝程度達到Complete水平;僅有煙曲霉Af293(2005 年完成)和構(gòu)巢曲霉FGSCA4(2008 年完成)的基因組達到Chromosome水平;41 條曲霉基因組記錄達到Scaffold水平,其中僅有1條記錄是米曲霉菌株(米曲霉RIB40,2005 年完成),1條是醬油曲霉菌株(醬油曲霉NBRC4239,2011 年完成);48 條曲霉基因組記錄達到Contig水平,其中8條是米曲霉,分別是3.042(2012 年完成)、AS 3.951(2012年完成)、AS 3.863(2012 年完成)、RIB326(2012年完成)、100-8(2014年完成)、BCC7051(2017年完成)、SRCM101975(2017年完成)、SRCM101989(2017年完成)。從以上數(shù)據(jù)可以看出,雖然曲霉的基因組學研究在真菌領(lǐng)域占比較少,基因組組裝水平不高,但就是這些不算完美的基因組信息卻在實際應用中極大推進了基因改造技術(shù)的發(fā)展。

      2005年,日本26 家科研單位利用全基因組鳥槍法共同測序完成了世界首例釀造用米曲霉RIB40基因組序列[6]。測序數(shù)據(jù)顯示,米曲霉基因組大小為37.6 Mb,分布在8條不同的染色體上,長度分別是6.4 Mb、6.2 Mb、5.0 Mb、4.8 Mb、4.4 Mb、4.1 Mb、3.4 Mb和3.3 Mb;七號染色體上還包含0.6 Mb的rDNA重復序列;線粒體序列為2.9 kb?;虻钠骄笮?.8 kb,是釀酒酵母基因大小的1.4倍。在最新的曲霉基因組數(shù)據(jù)庫中[7](截止2017年11月12 日),米曲霉 RIB40基因組中預測的編碼蛋白基因是12 090個(基因組基因12 074個,線粒體基因16 個),其中僅有205 個基因功能是經(jīng)過證實,占基因總數(shù)的1.7%。在8條染色體上分別分布著2 048、2 019、1 655、1 528、1 487、1 320、908和1 097個基因,同時還有12 個基因位于8條染色體以外的序列上。除此之外,米曲霉基因組上還有268 個tRNA序列和3 個rRNA序列。進一步對米曲霉基因組基因進行GO功能聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖1所示),在分子功能聚類中排名前3位為水解酶活力(hydrolase activity)、氧化還原酶活力(oxidoreductase activity)和轉(zhuǎn)運酶活力(transferase activity),基因數(shù)均超過1 000(超過注釋基因的8%),同時肽酶活力(peptidase activity)基因個數(shù)達到206;在細胞組分聚類中排名前3位為細胞核(nucleus)、膜(membrane)和細胞質(zhì)(cytosol),均有超過1 400個基因(超過注釋基因的10%);而在生物過程聚類中則有大量基因參與了糖類代謝(455個)、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝(401個)、脂類代謝(398 個)以及分泌蛋白加工轉(zhuǎn)運(2 681個)等過程。到目前為止,雖然米曲霉基因組中絕大部分基因的具體功能還是未知的,但從圖1相對全面的注釋數(shù)據(jù)來看,米曲霉是一種非常適合用于醬油等傳統(tǒng)食品釀造的微生物。

      米曲霉RIB40基因組測序完成之后,就陸續(xù)有針對其自身及其他品類米曲霉基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組研究成果的相關(guān)報道。VONGSANGNAK等[8]應用表達序列標簽技術(shù)分析米曲霉A1560基因組,鑒定了1 046個新基因;同時對米曲霉基因組數(shù)據(jù)庫中1 469個假定蛋白功能進行新的預測,并利用修訂后的基因組注釋重構(gòu)了米曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)。WANG等[9]利用RNA-Seq測序技術(shù)對米曲霉進行不同培養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)錄分析,判定12 074個蛋白編碼基因中有11 263個發(fā)生轉(zhuǎn)錄表達,使得米曲霉基因的注釋率達到93.28%;確定了4 198個基因的5′非翻譯區(qū)(5′-Untranslated Region,5'UTR)和4 357個基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR);確認了1 345個米曲霉基因的上游開放閱讀框(Upstream Open Reading Frame,uORF)和272個基因的上游起始密碼子(uATG),發(fā)現(xiàn)了1 166 個新轉(zhuǎn)錄本和800個新外顯子;確定了1 375個可變剪接事件。ZHAO等[10]通過比較米曲霉100-8和米曲霉3.042蛋白組學差異,鑒定出522 個胞內(nèi)蛋白,并發(fā)現(xiàn)部分與碳及氨基酸代謝有關(guān)的蛋白可能會促進醬油風味;后續(xù)又通過比較分析米曲霉100-8和米曲霉3.042基因組與轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)差異,獲得了2株菌在基因組水平上單核苷酸多態(tài)性、缺失及插入序列位點信息,轉(zhuǎn)錄組水平上的胞外蛋白酶差異表達基因,在基因水平揭示了2種米曲霉不同的分泌調(diào)控機制和由其導致發(fā)酵產(chǎn)品風味不同的原因[11]。因此通過對基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組綜合比較分析研究,使大家從全局上對米曲霉基因組信息及基因功能有了更加清晰的認識。

      2 米曲霉水解酶

      在傳統(tǒng)食品釀造過程中,米曲霉能夠分泌大量水解酶類,主要包括蛋白水解酶(蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶)和糖類水解酶(淀粉酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、植物水解酶)[12]。這兩大類酶系能夠?qū)⒃现械牡鞍踪|(zhì)及糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成多肽、氨基酸、寡糖及單糖,這些小分子物質(zhì)是構(gòu)成傳統(tǒng)發(fā)酵食品色、香、味、體的源泉[5]。但目前對于蛋白水解酶和糖類水解酶研究主要是集中在酶學性質(zhì)(包括:酶組分、酶學性質(zhì)、影響酶活因素)的研究[13-15];而對控制這些酶系表達基因的關(guān)注度不高,因此下面就從基因水平對這兩大酶系進行詳細闡述。

      2.1 蛋白水解酶

      蛋白水解酶包括內(nèi)肽酶及外肽酶。大部分內(nèi)肽酶可以根據(jù)催化活性中心分成4大類[16],即絲氨酸肽酶(serine endopeptidase)、半胱氨酸肽酶(cysteine endopeptidases)、天冬氨酸肽酶(aspartic endopeptidase)和金屬肽酶(metalloendopeptidase)。雖然每個類別肽酶的底物結(jié)合位點不同,但活性中心催化位點周圍氨基酸序列卻相對保守,因此這些保守的序列信息就被用來鑒別米曲霉不同的肽酶基因(表1所示)。

      表1 米曲霉基因組肽酶基因數(shù)量及氨基酸保守序列[6, 17]Table 1 The number of genes and conserved amino acid sequences of the peptidases in A. oryzae

      外肽酶根據(jù)作用方式劃分為氨肽酶(Aminopeptidases)、二肽酶(Dipeptidases)、二肽或三肽酶(Dipeptidyl or Tripeptidyl peptidases)以及羧肽酶(Carboxypeptidases),米曲霉外肽酶基因的預測是通過與公開數(shù)據(jù)庫已知外肽酶基因信息進行比對獲得(COGscores>150)[17]。對米曲霉的基因組整體預測分析發(fā)現(xiàn)(表1所示),米曲霉基因組上存在135 個肽酶基因,其中包含69 個外肽酶基因和66 個內(nèi)肽酶基因,占到米曲霉總基因數(shù)的1%[6]。而且米曲霉肽酶基因數(shù)量還遠超過構(gòu)巢曲霉(90 個)和煙曲霉(99 個)[6]。米曲霉基因組上有大量在酸性pH條件下發(fā)揮作用的分泌型肽酶基因,包括天冬氨酸蛋白酶、抑肽素鈍化蛋白酶(Pepstatin insensitive protease)、奧瑞素(Aorsin)、羧肽酶,這也許可以解釋為什么米曲霉適合在酸性pH條件下生長。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)[17],半數(shù)以上金屬蛋白酶(Metalloproteinases),大部分天冬氨酸蛋白酶(Aspartic proteinases)和絲氨酸型羧肽酶(Serine-type carboxypeptidases)都有一個典型的信號肽序列,可初步判定為分泌型蛋白酶。從這些數(shù)據(jù)分析可以看出,米曲霉具有豐富的分泌型肽酶,該特性使其被選擇用于富含蛋白質(zhì)原料的發(fā)酵應用。BUDAK等[16]通過綜合分析米曲霉RIB40等7種曲霉在麥麩和甜菜渣2種培養(yǎng)條件下基因組、蛋白組以及酶學檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)7種曲霉均含有大約占總基因數(shù)量3%(預測蛋白酶基因數(shù)量均超過300 個,胞外蛋白酶超過40 個)的蛋白酶基因,其中25%±1%屬于絲氨酸蛋白酶,18%±1%屬于金屬蛋白酶,8%±1%屬于氨基蛋白酶,5%屬于天冬氨酸蛋白酶。對7種曲霉蛋白組數(shù)據(jù)進行比較分析發(fā)現(xiàn),總共133種假定的蛋白酶基因被確認,其中米曲霉基因組上含有41個直系同源蛋白酶基因,包括5種氨基蛋白酶、7種天冬氨酸肽酶、1種半胱氨酸酶、6種金屬蛋白酶、17種絲氨酸蛋白酶和5種泛素化蛋白酶。實驗結(jié)果還表明,麥麩較甜菜渣能更好地誘導蛋白酶基因表達。但是通過最新曲霉數(shù)據(jù)庫[7]檢索發(fā)現(xiàn),目前僅有21種肽酶基因得到詳細的功能研究(pamA、pepAd、opsA、ocpO、ocpC、cdpA、damA、gdaA、lapA、apsB、apsA、mepB、dppIV、kexA、sedD、atg4、nptB、alpA、pepE、kexB、creB)。這說明目前蛋白酶系基因的研究主要側(cè)重于生物信息學方面的序列比較分析,要想更深入了解酶系基因的作用機理,則需要進一步對這些預測基因進行詳細的功能性研究。

      2.2 糖類水解酶

      米曲霉不僅能用于醬油及發(fā)酵醬的生產(chǎn),在日本還被用于酒類產(chǎn)品的發(fā)酵,包括清酒及燒酒,而且也有上千年的歷史,這主要是利用米曲霉豐富的糖類水解酶[18]。米曲霉的淀粉水解酶包含α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶,到目前為止大部分淀粉水解酶的基因功能已經(jīng)被證實[19]。KOBAYASHI等[17]對米曲霉RIB40的基因組進行比較分析發(fā)現(xiàn),米曲霉基因組上有5個α-淀粉酶、2個葡萄糖淀粉酶和5個胞外α-葡萄糖苷酶基因。與蛋白水解酶相比,淀粉水解酶的基因數(shù)量遠小于預期,但就是這些相對少量的基因卻保證了米曲霉強大的淀粉水解能力。米曲霉基因組上還存在大量的果膠水解酶基因(55 個)[6],但實際生長過程中的果膠水解能力并不強。其中糖基水解酶結(jié)合域的數(shù)量決定了原料生物質(zhì)的分解能力[20-21],但通過基因分析發(fā)現(xiàn)米曲霉含有纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain,CBD)或淀粉結(jié)合域(starch binding domain,SBD)的基因數(shù)量是明顯偏少;構(gòu)巢曲霉中有19 個水解酶含有CBD結(jié)合域,但米曲霉只有5個水解酶含有CBD結(jié)合域;黑曲霉的淀粉酶和至少一個葡萄糖苷酶有SBD結(jié)合域,但米曲霉中只有g(shù)laA含有SBD結(jié)合域[17]。通過上述結(jié)果可以支持這樣的假說[22]:米曲霉來源于野生的植物致病菌,但在長期馴化過程中利用容易分解的原料,導致果膠、纖維素以及生淀粉水解能力逐漸退化。COUTINHO等[23]利用CAZy family數(shù)據(jù)庫對米曲霉RIB40基因組預測分析,發(fā)現(xiàn)基因組上存在219 個糖類水解酶基因,其中71.7%(157 個)有分泌信號,17.8%(39 個)是非經(jīng)典分泌,10.5%(23 個)是在胞內(nèi)發(fā)揮作用。通過作用功能歸類分析,米曲霉基因組中有33 種糖苷酶,總計185 個基因;有5種多糖裂解酶,總計20 個基因;有3種糖類酯酶,共計14 個基因。由于多糖較蛋白質(zhì)組成成分簡單,目前糖類水解酶基因功能研究水平較蛋白水解酶相對全面。

      3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

      只通過酶系基因數(shù)量來衡量水解酶表達量的豐富程度具有一定局限性。在同等基因數(shù)量的前提下,不同培養(yǎng)時間及培養(yǎng)條件的酶系表觀活力是不一致的,這主要是轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平對基因?qū)崟r調(diào)控造成的。轉(zhuǎn)錄因子是通過與受調(diào)控基因啟動子區(qū)域順式作用元件發(fā)生相互作用來影響基因轉(zhuǎn)錄表達,在FTFD數(shù)據(jù)庫(fungal transcription factor database)中有570 個基因被預測為轉(zhuǎn)錄因子[24]。COUTINHO等[23]通過總結(jié)分析認為多糖水解酶的基因表達主要是受AbaA(AO090003001587)、AmyR(AO090003 001208)、AreA(AO090009000502)、BrlA(AO090005 001041)、CreA(AO090026000464)、PacC(AO090003 000758)、PecR、XlnR(AO090012000267)幾個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。CreA是碳分解代謝物阻遏蛋白[25],在葡萄糖或其他易代謝碳源存在條件下,抑制大部分糖類水解酶基因表達,例如淀粉水解酶等。AmyR是淀粉水解轉(zhuǎn)錄激活因子[26],α-淀粉酶、糖化酶及α-葡萄糖苷酶基因都是受AmyR轉(zhuǎn)錄因子激活調(diào)控。XlnR是木聚糖以及纖維素水解的轉(zhuǎn)錄激活因子[27],幾乎調(diào)控表達了所有參與木聚糖和纖維素降解基因,以及部分參與木葡聚糖和半乳甘露聚糖降解基因。PecR是預測參與果膠分解的轉(zhuǎn)錄激活因子[28],目前其具體功能還未進行詳細研究。還有一些多糖水解酶基因是由銨鹽相關(guān)調(diào)控因子AreA[29]以及pH調(diào)控蛋白PacC[17, 30]調(diào)控。另外在參與多糖降解基因的啟動子上還發(fā)現(xiàn)有發(fā)育調(diào)控因子AbaA[31]和BrlA[32]結(jié)合位點,但這些轉(zhuǎn)錄因子在糖類代謝中具體作用效果并未得到詳細評估[23]。目前對于蛋白水解酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究較少,只有一個得到較為詳細研究,PrtT[33-34](AO090003001577),該調(diào)控因子在米曲霉中參與了中性金屬蛋白酶(NpI)以及堿性絲氨酸蛋白酶(AIp)等蛋白酶基因的表達調(diào)控。除了這些專屬的轉(zhuǎn)錄因子外,還有一些全局性轉(zhuǎn)錄因子,也參與了分泌酶系基因的表達調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子FlbC[35](AO090026000200)不僅參與了孢子的發(fā)育調(diào)控,還參與了固態(tài)培養(yǎng)條件下葡萄糖淀粉酶以及蛋白酶基因的特異表達調(diào)控。轉(zhuǎn)錄激活因子CpcA[36](AO090009000459)參與到氨基酸生物合成途徑,在所有米曲霉轉(zhuǎn)錄因子中的相對表達水平最高。轉(zhuǎn)錄因子HacA[34](AO090124000074)參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)分子伴侶、磷脂代謝、脂肪酸合成、易位、蛋白糖基化、細胞壁合成、膜泡運輸、液泡蛋白定位和蛋白降解等過程。正由于這些特異性以及全局性轉(zhuǎn)錄因子對糖類及蛋白水解酶基因的動態(tài)調(diào)控表達,保證了米曲霉在不同環(huán)境條件下最優(yōu)生長。

      4 蛋白分泌途徑

      在傳統(tǒng)食品釀造過程中主要是利用米曲霉的分泌型糖類及蛋白水解酶來進行原料的降解。這些分泌酶基因經(jīng)過復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及分泌途徑的熟成加工,最終形成具有作用功能的酶系蛋白。已有研究表明米曲霉等絲狀真菌的蛋白分泌一般發(fā)生在菌絲頂端或亞頂端即頂端分泌,這種分泌方式在一定程度上決定了米曲霉高效分泌能力[37-38]。在蛋白分泌過程中,分泌蛋白相應的mRNA首先在核糖體上合成為多肽并靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER);隨后多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行折疊與修飾,例如糖基化、形成二硫鍵、磷酸化以及亞基組裝,發(fā)生錯誤折疊蛋白會激活非折疊蛋白反饋機制(unfolded protein response,UPR)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD);接著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊蛋白通過囊泡運輸轉(zhuǎn)運到高爾基體(golgi),在高爾基體中進一步對蛋白進行成熟加工以及糖基化;高爾基體中加工蛋白可能會被轉(zhuǎn)運到液泡(vacuole)降解;分泌蛋白則通過囊泡運輸?shù)郊毎げ⒎置诘郊毎鈁34]。蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體以及細胞膜等細胞器之間的傳輸是通過囊泡運輸實現(xiàn),其中SNARE蛋白是囊泡運輸中核心蛋白。在米曲霉基因組上有大約21 種不同SNARE蛋白基因[39],這些蛋白是水解酶蛋白正常分泌的重要保證。LIU等[40]對米曲霉基因組通過文獻總結(jié)和生物信息學分析,獲得目前最為全面示蹤米曲霉分泌機制的369 個分泌途徑組分基因,這些基因蛋白協(xié)同參與了蛋白分泌途徑的所有步驟和過程,保證了酶系蛋白在分泌系統(tǒng)中的高效翻譯、高效組裝修飾以及高效分泌。

      5 結(jié)語

      米曲霉不僅是傳統(tǒng)食品釀造行業(yè)中的核心菌株,而且還被廣泛應用于外源蛋白的表達宿主,LUBERTOZZI和KEASLING[41]統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)大約商業(yè)酶總量的50%是由米曲霉、黑曲霉以及李氏木霉等絲狀真菌生產(chǎn)。自2005 年米曲霉RIB40基因組測序完成之后,米曲霉分子遺傳改造效率就得到大幅度提高,YOON等[42]在米曲霉中實現(xiàn)了10 個蛋白酶基因的連續(xù)敲除,并以其作為宿主進行人溶菌酶(human lysozyme,HLY)和牛凝乳酶(bovine chymosin,CHY)異源表達,其表達量分別是野生型的3.2 倍和3.8 倍。同時對米曲霉進行基因組改造不僅能實現(xiàn)多達200 kb超大片段敲除[3],還能實現(xiàn)單個堿基精確刪除和插入[43],利用這些技術(shù)可以用來破壞對工業(yè)生產(chǎn)不利的基因,改善米曲霉生產(chǎn)效率。后續(xù)隨著組學新技術(shù)在米曲霉中應用,米曲霉將會朝著多組學協(xié)同研究的方向發(fā)展,在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)表達和代謝物分泌水平不同維度上系統(tǒng)分析細胞反應和調(diào)控機理,將有助于我們更加全面地理解米曲霉蛋白分泌調(diào)控機制,為米曲霉酶系表達研究提供全面的理論指導。

      由于基因組學現(xiàn)代遺傳改造技術(shù)應用于傳統(tǒng)食品釀造菌株的改造存在諸多限制,導致一直以來只能使用傳統(tǒng)的物理及化學方法進行米曲霉育種研究。傳統(tǒng)的菌種選育方式具有很大的盲目性和隨機性,選育效率非常低。同時對于菌種選育過程中菌株性能評價,只簡單的通過酶活力表觀指標進行衡量,沒有深入的理解和探究酶系相關(guān)基因?qū)τ诰N發(fā)酵性能的根本影響,評價結(jié)果往往具有一定的片面性。因此在我國后續(xù)的菌種研究過程中,如何有效利用基因組所包含的基因信息來指導和提高米曲霉菌種的選育效率以及尋找最適發(fā)酵條件,將會是一個值得深究的課題。

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