陳虹,徐東升,楊金生,白萬(wàn)柱,閆平慧,王瑩瑩

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艾灸對(duì)陽(yáng)陵泉穴區(qū)皮膚組織五羥色胺和組胺的影響

陳虹1,徐東升2,楊金生2,白萬(wàn)柱2,閆平慧1,王瑩瑩2

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),咸陽(yáng) 712046;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所,北京 100700)

運(yùn)用免疫組化結(jié)合共聚焦技術(shù)揭示艾灸對(duì)陽(yáng)陵泉穴區(qū)皮膚組織五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)的影響。以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,剃除雙后肢陽(yáng)陵泉穴區(qū)毛發(fā),充分暴露皮膚組織,對(duì)左側(cè)陽(yáng)陵泉穴進(jìn)行艾灸治療,灸后即刻灌流,并分別取兩側(cè)穴區(qū)皮膚組織(1 cm×1.5 cm),經(jīng)25%高滲糖脫水后用冰凍切片機(jī)制成20mm系列組織切片,然后分別用5-HT及HA抗體進(jìn)行熒光免疫組化檢測(cè)。艾灸后皮膚組織中5-HT和HA陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng),5-HT分別在表皮層與真皮層之間,皮下組織層沿血管形成連續(xù)的增強(qiáng)帶;HA主要集中分布在真皮層深部及皮下組織的血管旁。通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù),艾灸后皮膚組織中5-HT和HA陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)量明顯高于正常皮膚組織,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。艾灸能夠使陽(yáng)陵泉穴區(qū)皮膚組織中5-HT和HA的表達(dá)上調(diào),其可能參與艾灸作用通路的信息傳遞。

灸法;五羥色胺;組胺;穴,陽(yáng)陵泉

艾灸是通過(guò)溫?zé)岽碳ぜ八幬镒饔弥委熂膊〉闹嗅t(yī)傳統(tǒng)外治法[1]。在我國(guó)古代,熱灸療法早于針刺療法[2],至今仍廣泛應(yīng)用于臨床治療。以往研究從熱灸刺激信號(hào)的傳導(dǎo)通路入手,認(rèn)為艾灸的作用機(jī)制為熱灸刺激產(chǎn)生的物理和化學(xué)因子作用于腧穴感受裝置,通過(guò)外周傳入途徑,刺激信號(hào)傳入中樞,經(jīng)過(guò)信號(hào)整合傳出,從而起到調(diào)控作用[3-4]。然而這些研究基本是在宏觀和大解剖學(xué)水平上進(jìn)行的,而對(duì)于艾灸過(guò)程中的活性物質(zhì)參與及其級(jí)聯(lián)反應(yīng)的研究,目前鮮有報(bào)道。

近年來(lái),隨著體表醫(yī)學(xué)研究的深入,體表刺激的直接作用部位穴區(qū)成為研究熱點(diǎn),現(xiàn)已對(duì)穴區(qū)皮膚組織血管和神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了相關(guān)研究[5],并發(fā)現(xiàn)正常穴區(qū)局部存在組織細(xì)胞化學(xué)動(dòng)態(tài)變化[6],這為我們更深入了解穴區(qū)局部組織結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的構(gòu)成提供了新的視角。為了進(jìn)一步了解艾灸對(duì)穴區(qū)活性物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的影響,本實(shí)驗(yàn)擬以健康SD大鼠為研究對(duì)象,運(yùn)用免疫組化結(jié)合激光共聚焦技術(shù),觀察和比較穴區(qū)正常皮膚組織和艾灸皮膚組織中活性物質(zhì)五羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)和組胺(histamine, HA)的變化,以探索艾灸作用信息的傳導(dǎo)通路,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠6只,體質(zhì)量為(220±10)g,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCKX(軍)2007-004]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照并嚴(yán)格遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用指南》。

1.2 試劑與儀器

異氟烷(九派制藥有限公司,中國(guó))、兔抗5-HT抗體(rabbit anti5-HT, ab10385,Abcam,香港)、兔抗HA抗體(rabbit antiHA, ab123982, Abcam,香港)、Alexa 594熒光素化的山羊抗兔二次抗體(goat anti- rabbit Alexa 594secondary antibody, Molecular Probes,美國(guó))、核酸特異性熒光染料DAPI(40,6- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Mo- lecular Probes,美國(guó))、Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽(Alexa fluor 488 phalloidin, MolecularProbes,美國(guó))。

小動(dòng)物麻醉機(jī)(VMR, Matrx, Midmark,美國(guó))、蠕動(dòng)泵(BT300-2J,保定蘭格恒流泵有限公司)、陽(yáng)離子載玻片(Thermo, Erie Scient if ic Company,美國(guó))、恒冷箱切片機(jī)(FSE, Thermo, MicromInternational,德國(guó))、研究級(jí)正置顯微鏡(Olympus, BX53,日本)、全光譜掃描共聚焦顯微鏡(Olympus, FV1200,日本)。

1.3 艾灸治療

取雙側(cè)陽(yáng)陵泉穴,左側(cè)進(jìn)行艾灸刺激,右側(cè)為對(duì)照。定穴參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]中大鼠常用針灸穴位定位法,即陽(yáng)陵泉位于腓骨頭前下方凹陷處,距“后三里”穴上外側(cè)5 mm處。采用小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)對(duì)SD大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉,分別剃除大鼠雙后肢陽(yáng)陵泉穴區(qū)毛發(fā),充分暴露皮膚組織,使用艾條對(duì)左側(cè)陽(yáng)陵泉穴區(qū)進(jìn)行艾灸治療。艾條為大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)專用,呈圓柱狀,直徑為4 mm,長(zhǎng)120 mm,重量為6 g。艾條與皮膚垂直距離(3±0.5)cm,測(cè)溫槍監(jiān)測(cè)穴區(qū)體表溫度使其保持在(44±0.5)℃,艾灸治療10 min。詳見圖1。

圖1 大鼠陽(yáng)陵泉穴定位及艾灸操作

1.4 灌流取材

艾灸刺激后即刻對(duì)仍處于深度麻醉狀態(tài)下的大鼠進(jìn)行心臟灌流。具體操作為,迅速剪開胸腔,經(jīng)左心室將輸液針管插入升主動(dòng)脈,剪開右心耳,快速灌入生理鹽水100 mL,隨后灌入(320±10)mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液(phosphate bufferedsolution, PB, pH值為7.4)的固定液,約15 min灌流完畢。在灌流后大鼠兩側(cè)陽(yáng)陵泉穴區(qū)分別縱向切取長(zhǎng)約15 mm、寬約10 mm的皮膚組織,將其放置于上述同樣固定液中固定2 h,再換到含25%蔗糖的0.1 mol/L PB液(pH值為7.4)中,放置于4 ℃冰箱中約2 d,直至組織完全下沉。

1.5 組織切片制備

采用恒冷箱切片機(jī)進(jìn)行組織切片。先用組織包埋劑將皮膚組織黏貼在支架上,待凍結(jié)后將組織制成厚20mm的矢狀切片,直接貼在陽(yáng)離子載玻片上,并按順序分為兩組(艾灸組織與正常組織),然后放置于室內(nèi)陰干。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

兩組組織切片用0.1 mol/L PB液清洗3次,并用組化筆在組織周圍畫圈,將封閉液[3%山羊血清,0.5% Triton X-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)]用移液器滴加到組織切片上孵育0.5 h,移去封閉液,分別滴加一次抗體兔抗5-HT抗體(1:500)和兔抗HA抗體(1:500)的稀釋液[1%山羊血清、0.5% TritonX-100和0.1 mol/L PB(pH值為7.4)],并將裝有組織切片的濕盒置于4℃冰箱中過(guò)夜。次日經(jīng)0.1 mol/L PB液清洗后,加入含Alexa 594熒光素化的山羊抗兔二次抗體(1:500)、Alexa 488熒光素化的鬼筆環(huán)肽(1:50000)、核酸特異性熒光染料DAPI(1:1000)的上述稀釋液,于室溫內(nèi)靜置1.5 h后,用0.1 mol/L PB液清洗3次。待組織切片風(fēng)干后,滴加50%甘油,加蓋玻片完成標(biāo)本制作。整個(gè)操作過(guò)程中注意避光。

組織標(biāo)本用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察和拍照。圖片經(jīng)Adobe Photoshop CS2(Adobe Systems, San Jose, CA,美國(guó))進(jìn)行標(biāo)注和編輯。兩組組織切片在熒光顯微鏡10倍視野下分別選取12個(gè)面積相同的區(qū)域進(jìn)行5-HT、HA計(jì)數(shù),并用GraphPad Prism6軟件繪制柱狀圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用配對(duì)檢驗(yàn)。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

陽(yáng)陵泉穴區(qū)皮膚組織的表皮下、真皮、皮下組織均有5-HT陽(yáng)性標(biāo)記,艾灸組織(圖2B)較正常組織(圖2A)陽(yáng)性表達(dá)增多聚集,并分別在表皮層與真皮層之間及皮下組織層沿血管形成連續(xù)的增強(qiáng)帶;HA主要分布在正常組織和艾灸組織的真皮層深部及皮下組織的血管旁,但艾灸組織中的HA表達(dá)明顯上調(diào)(圖4);相同顯微鏡視野下5-HT和HA陽(yáng)性標(biāo)記數(shù)量比較(圖3、圖5),艾灸組明顯高于正常組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

需要說(shuō)明的是,本研究?jī)H對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了形態(tài)學(xué)描述,對(duì)其量的分析僅限于相同視野下的陽(yáng)性表達(dá)物數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析,是為進(jìn)一步證實(shí)其形態(tài)學(xué)分布趨勢(shì)而服務(wù),穴區(qū)局部皮膚組織中5-HT、HA含量變化可用生物化學(xué)技術(shù)在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定。

圖3 5-HT陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在正常組織和艾灸組織的計(jì)數(shù)

注:由HA、鬼筆環(huán)肽(Pha)和DAPI標(biāo)記的陽(yáng)陵泉穴區(qū),分別顯示為紅、綠、藍(lán)色,其中Epi、D、Sub分別代表表皮層、真皮層、皮下組織;A為HA在正常組織中的分布;B為HA在艾灸組織中的分布;A和B中箭頭的放大部位分別顯示HA在深層皮下組織(A1、B1)的分布

3 討論

本研究運(yùn)用熒光免疫組化結(jié)合共聚焦成像技術(shù),從活性物質(zhì)變化的角度,探索艾灸刺激可能存在的信息傳導(dǎo)通路。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),艾灸可使局部皮膚組織中5-HT、HA的表達(dá)明顯增強(qiáng);5-HT、HA具有明顯的趨血管性分布。

5-HT、HA作為神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)因子,由存在于皮膚中的內(nèi)分泌細(xì)胞和免疫細(xì)胞(包括角質(zhì)形成細(xì)胞、Merkle細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及T細(xì)胞等)所分泌[8-11]。本研究結(jié)果顯示5-HT、HA陽(yáng)性表達(dá)的變化與艾灸刺激對(duì)皮膚-內(nèi)分泌系統(tǒng)和皮膚-免疫系統(tǒng)的激活密切相關(guān)。朱兵等[2]證實(shí),艾灸刺激可以通過(guò)Ad類纖維和C類纖維興奮皮膚中的溫?zé)岣惺芷骱虲-多型傷害感受器,感覺神經(jīng)元通過(guò)軸突反射釋放神經(jīng)肽到皮膚的表皮或真皮的神經(jīng)末稍,介導(dǎo)多種如內(nèi)分泌細(xì)胞和免疫細(xì)胞等靶細(xì)胞的活性,釋放相關(guān)激素和活性物質(zhì)。唐照亮等[12]亦發(fā)現(xiàn)艾灸刺激可以通過(guò)調(diào)節(jié)組織源性炎性介質(zhì)HA、5-HT,減輕或緩解炎癥反應(yīng),參與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。HA、5-HT具有擴(kuò)血管作用[13-16],HA還可增加毛細(xì)血管的通透性,艾灸對(duì)經(jīng)穴的刺激作用,能激活血管的自律運(yùn)動(dòng),改善局部微循環(huán)[17]。所以,筆者推測(cè)艾灸后血管周圍HA、5-HT的陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)與艾灸改善局部微循環(huán)作用相關(guān)。

5-HT、HA可能參與鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的信息傳導(dǎo)。HA在腦內(nèi)對(duì)痛覺具有調(diào)節(jié)作用,在脊髓水平對(duì)痛覺具有傳導(dǎo)作用[18];在中樞下行的5-HT能神經(jīng)元能夠激活抑制性中間神經(jīng)元而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,在外周5-HT受體能夠參與疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)[19]。筆者發(fā)現(xiàn)艾灸刺激可以通過(guò)對(duì)HA、5-HT表達(dá)的調(diào)控參與鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的信息傳導(dǎo),這與楊介賓等[20]發(fā)現(xiàn)艾灸可調(diào)控致痛因子HA、5-HT而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛的效應(yīng)觀點(diǎn)一致。另外,相關(guān)臨床研究[21-24]和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[25-27]均證明,艾灸能夠通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸的5-HT通路來(lái)實(shí)現(xiàn)降低腸易激綜合征患者或大鼠的內(nèi)臟痛的程度。

總之,正常情況下皮膚處于穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu),艾灸刺激可以打破這種穩(wěn)態(tài),使其由靜止轉(zhuǎn)為激活狀態(tài),其中5-HT和HA成分的增加表明其可能參與艾灸作用通路信息傳遞過(guò)程。以本研究為基礎(chǔ),深入探討艾灸刺激對(duì)穴區(qū)活性物質(zhì)的表達(dá)變化的影響,不僅有助于在生物學(xué)層面上揭示艾灸作用機(jī)制的始動(dòng)環(huán)節(jié),而且使灸刺激不同穴區(qū)活性物質(zhì)表達(dá)的共性和特異性研究成為可能。本研究結(jié)果提示從穴區(qū)局部組織入手研究與艾灸始動(dòng)環(huán)節(jié)密切相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)將會(huì)成為今后艾灸作用機(jī)制研究的一個(gè)重要發(fā)展方向。

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Effect of Moxibustion on the Expressions of 5-Hydroxytryptamine and Histamine in Skin Tissue at Yanglingquan (GB34)

1,2,2,2,1,2.

1.,712046,; 2.100700,

To investigate the influence of moxibustion on the expressions of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and histamine (HA) in skin tissue at Yanglingquan (GB34) by using immunohistochemistry combined with confocal technique.The rat was used in this experiment. The skin tissue on hind limbs Yanglingquan (GB34) was exposed by shaving. Subsequently, moxibustion was carried out on the left side of Yanglingquan (GB34). After moxibustion, the local skin tissue of 1 cm × 1.5 cm on bilateral Yanglingquan (GB34) of rats were collected, and put into 25% sucrose solution. The tissues were sliced at 20mm on a cryostat. The 5-HT and HA antibodies were used for fluorescent immunohistochemical test.The positive expressions of 5-HT and HA increased in the local skin tissue after moxibustion, in which 5-HT increased between the epidermis and dermis, in subcutaneous tissue layer forming a continuous band of enhancement along the blood vessels, while HA was majorly distributed nearby the blood vessels of deep dermis and subcutaneous tissue. After counting the positively-expressed 5-HT and HA by microscopic field of view, the numbers of 5-HT and HA positive markers were significantly lager in post-moxibustion skin tissue than in normal skin tissue. The differences were statistically significant (＜0.05).Moxibustion plays a role in up-regulating the level of 5-HT and HA in the local skin tissue at Yanglingquan (GB34). It suggests that 5-HT and HA may be involved in the signal transduction of moxibustion-related pathways.

Moxibustion; 5-Hydroxytryptamine; Histamine; Acupoint, Yanglingquan (GB34)

1005-0957(2018)13-0103-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.13.0103

2018-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81674079);北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(17G40199)

陳虹(1988—),女,2015級(jí)碩士生,Email:799678916@qq.com

王瑩瑩(1981—),女,主任醫(yī)師,博士,Email:YYW261206@126.com