蔡浩，楊通印，劉延，劉江偉，黃建釗

(1遂寧市中醫(yī)院，四川遂寧629000；2貴州省人民醫(yī)院)

腫瘤間質(zhì)比(TSR)指腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞部分和間質(zhì)成分之比。隨著對腫瘤微環(huán)境研究的深入，越來越多的證據(jù)表明腫瘤間質(zhì)成分在腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等過程中扮演重要角色[1]；TSR是結(jié)直腸癌、食管癌、鼻咽癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種實(shí)體腫瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素[2,3]。本研究分析原發(fā)性肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)患者TSR及其臨床意義。

1 臨床資料

研究對象為2009年1月～2015年10月貴州省人民醫(yī)院收治的91例肝癌患者，男75例，女16例；年齡18～75歲、中位年齡50歲，≥50歲52例、<50歲39例；術(shù)前AFP≥400 ng/mL 38例，<400 ng/mL 53例；HBsAg陽性82例；肝硬化46例。91例患者均行根治性肝癌切除術(shù)，腫瘤最大直徑≥5 cm 64例，<5 cm 27例；單個病灶70例，多個病灶21例；有衛(wèi)星結(jié)節(jié)13例；包膜侵犯29例；低分化10例，中高分化81例；脈管癌栓陽性34例；TNM分期Ⅰ期43例，Ⅱ期31例，ⅢA期17例。圍術(shù)期輸血43例；術(shù)后經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞(TACE)63例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未行放化療、介入及生物靶向治療；術(shù)前肝功能為Child-Pugh A級或B級；術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞性肝癌；實(shí)驗(yàn)室檢查、病理及影像資料齊全；術(shù)后規(guī)律隨訪，且隨訪時間大于1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并肝外轉(zhuǎn)移、臨近臟器侵犯或門靜脈、肝靜脈肉眼可見癌栓；術(shù)后病理診斷膽管細(xì)胞癌或混合型肝癌；術(shù)后因復(fù)發(fā)再次手術(shù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。評估結(jié)果的一致性采用Kappa指數(shù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)。單因素分析采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正或秩和檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 肝癌組織TSR檢測及TSR與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TSR檢測方法參照文獻(xiàn)[3]：肝癌組織病理切片行HE染色，采用40×放大倍數(shù)顯微鏡觀察腫瘤浸潤最明顯的區(qū)域(該區(qū)域主要由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)兩部分組成)。在該區(qū)域內(nèi)用100倍放大鏡評估單個視野范圍內(nèi)所有腫瘤細(xì)胞面積百分比，間質(zhì)百分比即為該視野剩余面積百分比，由此計(jì)算腫瘤組織內(nèi)部的TSR。選取多個視野進(jìn)行評估(評估視野>2個)，以間質(zhì)百分比最高視野的評估結(jié)果作為最終取值。為排除癌旁組織的干擾，視野區(qū)域的間質(zhì)四周必須有腫瘤組織包繞。根據(jù)既往的研究結(jié)果，本研究以TSR=50%作為截?cái)嘀担?TSR<50%定義為間質(zhì)豐富，≥50%定義為間質(zhì)稀少。為了保證評估結(jié)果不因評估者的主觀性導(dǎo)致偏差，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師均在不了解患者資料的情況下獨(dú)立進(jìn)行評估。完成所有患者病理切片評估后，如果兩位評估者評定結(jié)果間的誤差>10%，則由第三位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師再次評估并決定最終取值。對于難以肉眼評估的切片或評估值在40%～60%者，采用Image Pro-Plus(IPP)圖像分析軟件進(jìn)行TSR的最終取值。結(jié)果顯示，兩位專家同時評定TSR<50% 17例，TSR≥50% 68例，其中6例存在差異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件分析兩者評估的Kappa指數(shù)值為0.81，提示評估結(jié)果的一致性良好。

最終評定結(jié)果為間質(zhì)豐富20例、間質(zhì)稀少71例。間質(zhì)豐富及間質(zhì)稀少患者術(shù)前AFP≥400 ng/mL分別為14例(70%)、24例(33.8%)，組間比較P<0.01；脈管癌栓陽性分別為18例(90%)、16例(22.5%)，組間比較P<0.01。兩者年齡、性別、HBsAg、肝硬化、腫瘤最大直徑、腫瘤TNM分期、腫瘤病灶個數(shù)等臨床病理參數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.3 TSR與患者早期復(fù)發(fā)的關(guān)系 患者術(shù)后均進(jìn)行1年隨訪，將肝內(nèi)出現(xiàn)新發(fā)癌灶判定為早期復(fù)發(fā)。間質(zhì)豐富及間質(zhì)稀少者早期復(fù)發(fā)率分別為90.0%(18/20)、45.1%(32/71)，兩組比較P<0.01。

3 討論

腫瘤間質(zhì)主要由基底膜、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、免疫細(xì)胞、血管及各種細(xì)胞或生長因子等組成。在正常組織中，間質(zhì)成分可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖而抑制腫瘤發(fā)生。雖然間質(zhì)中的宿主細(xì)胞具有抑制腫瘤生長的能力，但間質(zhì)在惡性腫瘤中會發(fā)生變化，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。間質(zhì)是腫瘤生長的“土壤”，可以引起基因組不穩(wěn)定、為腫瘤組織的生長提供支架和屏障、產(chǎn)生免疫豁免區(qū)域、誘導(dǎo)雙向分化和形成微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的形成。間質(zhì)構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境是一個動態(tài)的過程。腫瘤起始細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞在適宜的微環(huán)境生長可刺激局部微環(huán)境形成適合腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境具有組織缺氧、pH值降低和腫瘤血管生成等特點(diǎn)。缺氧相關(guān)信號的激活可以重塑細(xì)胞外基質(zhì)。pH值降低可導(dǎo)致在DNA復(fù)制過程中起重要作用的DNA解螺旋酶和多聚酶等多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常；酸性微環(huán)境可促進(jìn)腫瘤侵襲[4]。間質(zhì)影響腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制包括細(xì)胞黏附、蛋白水解、基質(zhì)重塑和細(xì)胞骨架重排等[1]。腫瘤的侵襲發(fā)生在腫瘤與間質(zhì)的微生態(tài)環(huán)境中，間質(zhì)與腫瘤細(xì)胞間進(jìn)行酶和細(xì)胞因子的交換。侵襲所需要的主要酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等由宿主間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，并不是由侵襲的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生[5]。間質(zhì)中非細(xì)胞成分也可通過影響腫瘤細(xì)胞的信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為。TSR能反映腫瘤組織內(nèi)部間質(zhì)部分的含量，因此能預(yù)測多種實(shí)體腫瘤患者的預(yù)后。既往的研究結(jié)果表明，TSR增加可能會促進(jìn)腫瘤侵襲，并可能導(dǎo)致患者不良的臨床預(yù)后[6]。

表1 間質(zhì)豐富與間質(zhì)稀少者臨床病理參數(shù)比較(例)

有研究報(bào)道，TSR與肝癌患者TNM分期關(guān)系密切，TNM Ⅲ、Ⅳ期患者較Ⅰ、Ⅱ期患者具有更高的TSR[7]。本研究中肝癌Ⅰ、Ⅱ期患者74例、ⅢA期患者17例，均為早期肝癌患者，故間質(zhì)豐富者所占比例低于間質(zhì)稀少者。脈管癌栓被公認(rèn)為是評估肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的最重要的病理指標(biāo)之一[8～11]。即使在小肝癌患者中，脈管癌栓也與患者復(fù)發(fā)風(fēng)險及遠(yuǎn)期生存率低密切相關(guān)[12]。脈管癌栓的形成是癌細(xì)胞逐步侵犯周圍組織的一個過程，其中包含了癌細(xì)胞克隆性增生，侵犯周圍基質(zhì)，破壞內(nèi)皮細(xì)胞，侵入微血管，形成微癌栓，癌栓增大、脫落、轉(zhuǎn)移等過程。微血管受侵犯常預(yù)示腫瘤有轉(zhuǎn)移的趨勢。微血管是肝癌轉(zhuǎn)移的主要通道，是轉(zhuǎn)移的首站[13]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫標(biāo)志物CD44+/CD133+與微血管侵犯有關(guān)，天冬氨酸/天冬酰胺羥化酶(ASPH)過表達(dá)可提高癌細(xì)胞的侵襲能力[14]。 microRNA、血清淀粉樣蛋白、脫-γ-羥基凝血酶原水平變化在一定程度上可提示脈管癌栓的存在，且部分指標(biāo)與肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)。FOXC1是微血管侵犯的預(yù)測因子之一，抑制FOXC1表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)程序，為降低肝癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移提供潛在的分子干預(yù)靶點(diǎn)[15]。AFP是在肝癌發(fā)生過程中的衍生產(chǎn)物，能在一定程度上反映腫瘤增殖和腫瘤負(fù)荷。既往研究結(jié)果顯示，術(shù)前AFP陽性是肝癌微血管侵犯的危險因素，術(shù)前AFP水平越高，發(fā)生微血管侵犯的風(fēng)險越高[16]。本研究間質(zhì)豐富者術(shù)前AFP≥400 ng/mL及脈管癌栓陽性者所占比例均大于間質(zhì)稀少者，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。

本研究結(jié)果提示，TSR與肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)有關(guān)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)被認(rèn)為是肝癌間質(zhì)中最重要的成分之一[17]。與正常成纖維細(xì)胞比較，CAFs不僅有更強(qiáng)的增殖能力，而且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、增殖、代謝再編程、血管移位、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等特點(diǎn)[18]。CAFs能產(chǎn)生影響上皮細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)，TGF-β 能促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向活化的M2型細(xì)胞轉(zhuǎn)化；其中TGF-β1調(diào)節(jié)致癌性的miRNA，促進(jìn)肝癌進(jìn)展。腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(TAMs)可遷移至腫瘤的間質(zhì)，釋放內(nèi)容物促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，或進(jìn)入缺血、缺氧的壞死區(qū)域刺激血管生成。M2型巨噬細(xì)胞抑制適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤增殖、血管生成和EM重構(gòu)。最終腫瘤細(xì)胞逃過免疫屏障發(fā)生侵襲。

綜上所述，原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者TSR與血清AFP水平及脈管癌栓形成有關(guān)，且是患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的影響因子之一。