王碧榮 李衛(wèi)東 鄧旭斌 方盛華 王 慧

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科，廣東 廣州 510095)

肺癌發(fā)病率和死亡率都逐年升高，尤其是晚期肺癌，治療手段以化療及靶向治療為主，而目前化療藥物療效出現(xiàn)瓶頸，尋找新的化療藥物是晚期肺癌治療的熱點(diǎn)〔1〕?；熕幬锎蟛糠钟商烊恢参锾釤捇蛘咛烊恢参锍煞趾铣桑虼颂烊恢参餅榛熕幬镒龀隽藰O大的貢獻(xiàn)〔2〕。藻藍(lán)蛋白是一種無副作用的天然植物營養(yǎng)物質(zhì)，已經(jīng)被廣泛添加到食品中。有相關(guān)研究顯示，藻藍(lán)蛋白可以抑制體內(nèi)和體外癌細(xì)胞的增殖〔3，4〕。而之前也有報(bào)道指出甜菜堿也具有抗腫瘤的效果，并且這種抗腫瘤的作用可能是通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和穩(wěn)定癌癥抑制基因的甲基化所介導(dǎo)的〔5〕。由于甜菜堿與藻藍(lán)蛋白均有無毒及抗癌作用，是否可成為新的化療藥物是當(dāng)前研究焦點(diǎn)。關(guān)于甜菜堿和藻藍(lán)蛋白對(duì)于人肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期和增殖影響的研究甚少。本研究旨在探索甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)以及聯(lián)合使用對(duì)肺癌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑 甜菜堿(≥99%)，藻藍(lán)蛋白(≥95%)(Sigma，美國)，胎牛血清(Hyclone 公司，美國)，RPMI1640 培養(yǎng)液(Gibco 公司，美國)，MTT試劑盒，蛋白提取試劑盒(Invitrogen 公司，美國)，兔抗人MAPK抗體和兔抗人β-actin抗體(Abcam，美國)。

1.2細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株 A549 細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 裸鼠〔許可證號(hào)：SCXK(粵)2013-0008〕40只，體重18～22 g，購于廣東醫(yī)科大學(xué)，于無菌培養(yǎng)室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清+1%抗生素的 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為5% CO2，相對(duì)濕度95%，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2荷瘤裸鼠模型 無菌環(huán)境中定期喂食裸鼠滅菌好的鼠糧和水1 w后，酒精消毒裸鼠背部皮膚，開始接種制備好的A549細(xì)胞懸液(1×106/200 μl)用1 ml注射器接種于裸鼠右側(cè)背部皮下，制成人肺癌裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型成功后(注射點(diǎn)無破潰紅腫，皮下結(jié)節(jié)直徑>0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn))，將裸鼠隨機(jī)分成4組(對(duì)照組，甜菜堿組，藻藍(lán)蛋白組，甜菜堿+藻藍(lán)蛋白組)，每組10只。無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積(TV)，30～50 mm3時(shí)開始給裸鼠喂藥，甜菜堿組裸鼠每次給10%甜菜堿0.2 ml。藻藍(lán)蛋白組每次給藥0.2 ml，劑量為100 μg/L，聯(lián)合組給10%甜菜堿+100 μg/L藻藍(lán)蛋白；對(duì)照組每天每次注射0.2 ml 生理鹽水，連續(xù)給藥3 w，1次/d，均采用腹腔注射，給藥后正常喂鼠糧和水。每周測量一次實(shí)體瘤的大小，并記錄結(jié)果。TV=0.5×長徑×(短徑)2。

1.4.3MTT實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期A549細(xì)胞，每孔2×103/100 μl細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，每孔加入不同濃度甜菜堿(0.01%、0.10%、1.00%和4.00%)或藻藍(lán)蛋白(10、20、30和40 μg/L)或?qū)?yīng)的聯(lián)合作用組合；在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。細(xì)胞在處理完畢之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl 充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，ELX800)在波長490 nm處讀取吸光度(A490)值。增殖效率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值。

1.4.4Western印跡試驗(yàn) A549細(xì)胞5×105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞長至90%左右時(shí)，分別加入4%甜菜堿，40 μg/L藻藍(lán)蛋白和4%甜菜堿+40 μg/L藻藍(lán)蛋白，對(duì)照組加入無血清1640培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24 h和48 h提取細(xì)胞蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定每組蛋白質(zhì)濃度，每孔總蛋白上樣量為30 μg，上完樣后進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后轉(zhuǎn)膜(120 V，90 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。分別加入MAPK抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗37℃搖床反應(yīng)1 h，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行顯色后凝膠成像分析系統(tǒng)(中國，Tanon 5200)拍照后采用LabWorks4.6軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 A549細(xì)胞5×105/孔接種于6孔版中，待細(xì)胞長至90%左右時(shí)分別加入4%甜菜堿，40 μg/L藻藍(lán)蛋白和4%甜菜堿+40 μg/L藻藍(lán)蛋白，對(duì)照組加入無血清1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h用胰酶消化收集細(xì)胞1×105，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，棄上清，加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12 h，PBS洗滌去乙醇，離心5 min(2 500 r/min)，洗2次。0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入碘化錠(PI)和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37℃溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀(BD Influx)上機(jī)測定細(xì)胞周期。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析、HSD-q檢驗(yàn)，兩因素析因方差分析、LSD-t檢驗(yàn)，重復(fù)測量資料則行重復(fù)測量方差分析、組間LSD-t檢驗(yàn)、時(shí)間差值t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞A549活性 隨著甜菜堿濃度的增加，肺癌細(xì)胞A549活性出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與對(duì)照組(0)相比，甜菜堿的濃度為0.01%和0.10%時(shí)A549細(xì)胞的活性顯著增加，而4%的甜菜堿時(shí)A549細(xì)胞的活性顯著降低(均P<0.05)。藻藍(lán)蛋白作用A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的活性并沒有發(fā)生太大的變化，僅當(dāng)藻藍(lán)蛋白濃度增加到最高濃度時(shí)，細(xì)胞的活性相比對(duì)照組才出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。二者聯(lián)合使用(A：甜菜堿，B：藻藍(lán)蛋白)時(shí)細(xì)胞活性降低(AB交互作用P<0.05)。當(dāng)甜菜堿的濃度為4%時(shí)，無論是單獨(dú)作用還是和藻藍(lán)蛋白聯(lián)合使用，細(xì)胞的活性亦有明顯降低(P<0.05)。見表1、表2。

2.2流式細(xì)胞儀檢測甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞A549周期 甜菜堿組、藻藍(lán)蛋白組及兩者聯(lián)合組在G2/M期出現(xiàn)明顯細(xì)胞受阻，甜菜堿組處于G2/M期的比例為50.73%，藻藍(lán)蛋白組為17.39%，甜菜堿與藻藍(lán)蛋白聯(lián)合組為58.19%，均高于對(duì)照組的7.98%(P<0.05)。表明甜菜堿和藻藍(lán)蛋白聯(lián)合使用將A549細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。見表3。

表1 甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)對(duì)肺癌細(xì)胞A549活性的影響

1)2)3)4)分別為與A、B、C、D組比較：P<0.05

表2 甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞A549活性的影響

表3 甜菜堿、藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞A549周期的影響(%,n=6)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.3Western印跡法檢測甜菜堿和藻藍(lán)蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞A549內(nèi)MAPK蛋白的表達(dá) 甜菜堿和藻藍(lán)蛋白分別和聯(lián)合作用A549細(xì)胞24 h，A549細(xì)胞內(nèi)MAPK蛋白水平表達(dá)均有明顯升高(P<0.05)，而48 h MAPK蛋白水平更加顯著，其中甜菜堿和藻藍(lán)蛋白聯(lián)合作用A549細(xì)胞時(shí)，MAPK蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.05)(見表4)。這表明甜菜堿和藻藍(lán)蛋白均能促進(jìn)肺癌細(xì)胞株MAPK蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞株增殖。

2.4甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞A549荷瘤鼠TV的影響 荷瘤鼠分別喂食甜菜堿和藻藍(lán)蛋白后，TV與對(duì)照組比較呈減小趨勢，同時(shí)喂食

甜菜堿和藻藍(lán)蛋白后與二者單獨(dú)作用相比，TV更趨減小。2 w時(shí)，單獨(dú)喂食甜菜堿和藻藍(lán)蛋白組，二者聯(lián)合喂食組與對(duì)照組相比，TV均明顯減小(P<0.05)。3 w時(shí)，單獨(dú)喂食甜菜堿和藻藍(lán)蛋白組，二者聯(lián)合喂食組與對(duì)照組相比，TV亦分別減小(P<0.05)。提示甜菜堿和藻藍(lán)蛋白二者聯(lián)合使用的殺瘤效果要強(qiáng)于單獨(dú)使用。見表5。

表4 甜菜堿和藻藍(lán)蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞A549內(nèi)MAPK蛋白表達(dá)的影響

1)2)3)分別為與A、B、C組相比：P<0.05；4)為與24 h比較：P<0.05

表5 甜菜堿和藻藍(lán)蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞A549荷瘤鼠TV的影響

1)2)3)分別為與A、B、C組相比：P<0.05；4)為與0 w時(shí)比較：P<0.05

3 討 論

肺癌的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因甲基化關(guān)系密切，穩(wěn)定抑癌基因的甲基化對(duì)抑制腫瘤的發(fā)生有重要意義。甜菜堿是一種高效的甲基提供者，它對(duì)于穩(wěn)定DNA甲基化的過程具有重要作用。甜菜堿廣泛存在于多種天然植物及食品中〔6〕，而體內(nèi)的膽堿也可通過肝臟和腎臟氧化成甜菜堿〔7〕。同時(shí)甜菜堿細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性和信號(hào)功能，神經(jīng)傳導(dǎo)素的合成中起到重要作用。因此，目前甜菜堿被應(yīng)用于治療心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。而在惡性腫瘤中研究表明，甜菜堿能抑制白血病細(xì)胞株、肉瘤細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞，結(jié)腸腺癌細(xì)胞，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)和抑癌基因的甲基化來抑制癌細(xì)胞的增殖〔8～11〕。在肝癌研究中，Zhou等〔6〕發(fā)現(xiàn)甜菜堿聯(lián)合膽堿可降低原發(fā)性肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在肺癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)甜菜堿可降低其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔12〕，但目前對(duì)甜菜堿降低肺癌發(fā)生的機(jī)制未明確。藻藍(lán)蛋是藻膽蛋白家族成員之一，具有光能作用。藻膽蛋白由于其富含豐富的脂肪，維他命，微量金屬，葉綠素，β-胡蘿卜素和多糖等組分，因此是一種重要的天然植物〔13〕。有研究表明，藻藍(lán)蛋白具有抗氧化、抗突變、抗病毒，免疫刺激等多種生物學(xué)功能〔14〕。而在抗腫瘤中，Yang等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白可以抑制體外宮頸癌HeLa細(xì)胞和肺癌細(xì)胞株A459的增殖，其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及介導(dǎo)細(xì)胞溶解有關(guān)。

綜上所述，甜菜堿與藻藍(lán)蛋白均有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用，而兩者聯(lián)合作用，是否有更顯著的抑瘤作用，目前國內(nèi)外研究甚少。

本研究結(jié)果顯示，甜菜堿可以有效降低肺癌細(xì)胞A549的存活率，而且隨著濃度的升高，抑制肺癌細(xì)胞株增殖越明顯，這結(jié)果與Guo等〔16〕報(bào)道的不同濃度甜菜堿處理Hela和HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。而在藻藍(lán)蛋白抑制實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，抑制肺癌細(xì)胞增殖也有所增強(qiáng)，但總體上藻藍(lán)蛋白抑瘤作用不是非常明顯，這與張成等〔17〕研究藻藍(lán)蛋白在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的結(jié)果存在差異。當(dāng)藻藍(lán)蛋白與甜菜堿聯(lián)合時(shí)，可明顯抑制了肺癌A459細(xì)胞株的生長，抑制效果比單獨(dú)使用甜菜堿或者藻藍(lán)蛋白均強(qiáng)，這結(jié)果與Yang等〔15〕的研究比較相似。其中一種原因可能是由于藻藍(lán)蛋白的來源不同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不同，另一種因素可能與藻藍(lán)蛋白光能作用起到協(xié)同其他藥物促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要是通過兩種不同的細(xì)胞內(nèi)通路引起，分別由死亡受體和線粒體的激活所介導(dǎo)，其中線粒體的介導(dǎo)激活與藥物或者放射治療有關(guān)，作用機(jī)制可能是藥物可激活細(xì)胞內(nèi)的p38 MAPK的表達(dá)，p38 MAPK可激活線粒體的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能，這表明它激活是藥物引起細(xì)胞凋亡的必要過程〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示甜菜堿和藻藍(lán)蛋白有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK蛋白的表達(dá)，從而激活線粒體功能抑制肺癌A459細(xì)胞株增殖，而且兩者聯(lián)合并且作用時(shí)間越長，表達(dá)含量越高，可能抑制肺癌細(xì)胞株增殖的功能越強(qiáng)。細(xì)胞周期中G1期是細(xì)胞增殖復(fù)制的起點(diǎn)，而G2/M期是細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的關(guān)鍵點(diǎn)，這兩個(gè)時(shí)點(diǎn)受到抑制均可導(dǎo)致細(xì)胞周期復(fù)制阻塞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此細(xì)胞周期的功能失調(diào)對(duì)于癌癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，特別是對(duì)G1和G2/M期的調(diào)控，將成為惡性腫瘤治療的熱點(diǎn)。在本研究中，甜菜堿與藻藍(lán)蛋白均可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞株A459細(xì)胞周期在G1期出現(xiàn)細(xì)胞比例下降，而在G2/M期出現(xiàn)細(xì)胞堆積，這表明兩者均能抑制肺癌細(xì)胞進(jìn)入G1復(fù)制期和G2/M有絲分裂期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中甜菜堿作用效果更加明顯，而且與濃度呈正相關(guān)。與單獨(dú)用甜菜堿組相比，聯(lián)合藻藍(lán)蛋白組中，G1期的細(xì)胞數(shù)量，而G2/M期細(xì)胞數(shù)量增多。這表明甜菜堿聯(lián)合藻藍(lán)蛋白調(diào)控肺癌細(xì)胞株作用更加顯著。本研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿和藻藍(lán)蛋白具有抑制肺癌細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞周期增殖的作用，而兩者聯(lián)合使用時(shí)，抑制作用更加顯著，藻藍(lán)蛋白可能有協(xié)同甜菜堿作用。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kim等〔19〕在結(jié)腸癌腫瘤鼠模型中結(jié)果相似，表明甜菜堿可以明顯抑制ROS的產(chǎn)生并且降低氧化型谷胱甘肽的濃度，從而起到抗氧化作用而抑制腫瘤生長。藻藍(lán)蛋白作為富含半胱氨酸/甲硫氨酸的蛋白質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)pH來影響甜菜堿的吸收，而且可以通過激活線粒體功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，甜菜堿與藻藍(lán)蛋白在體內(nèi)研究中也存在著協(xié)同作用。本研究結(jié)果顯示：甜菜堿與藻藍(lán)蛋白在體內(nèi)也可以抑制肺癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤縮小。

綜上所述，藻藍(lán)蛋白和甜菜堿在體內(nèi)外均能抑制肺癌細(xì)胞增殖，而且兩者聯(lián)合時(shí)作用更加明顯，該結(jié)果雖然未能完全闡明兩者聯(lián)合對(duì)肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，但為探索甜菜堿和藻藍(lán)蛋白是否能成為新的抗腫瘤藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。