王安琪, 朱華新, 趙 翔, 崔建霞, 王 琰, 崔海信

中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所, 北京 100081

隨著20世紀末納米科技的興起，納米材料因具備小尺寸效應、表面效應、生物兼容性、可生物降解性等優(yōu)良性能，以及基本無毒、無免疫原性等優(yōu)勢，成為制備高效的靶向性基因載體系統(tǒng)的良好介質(zhì)，且在生物醫(yī)學領域得到了廣泛應用，并成為領域內(nèi)的研究熱點[1]。

納米基因載體是一類由生物兼容性材料通過分子自組裝的方法制備而成的、用于介導基因運載的納米微囊或納米粒子的總稱，如納米脂質(zhì)體、磁性顆粒納米載體、量子點(納米微晶體)、陽離子聚合物納米載體、多孔體顆粒納米載體等[2]，可在其表面修飾相應基團以包裹或吸附偶聯(lián)外源DNA等核酸分子，從而形成納米基因載體復合物，再通過化學鍵作用或靜電吸附作用與細胞表面的受體結(jié)合，利用細胞胞吞作用實現(xiàn)基因的靶向輸送[3]。納米基因載體的粒徑一般在10～100 nm之間，大比表面積產(chǎn)生的化學活性使其可高效的吸附DNA，且能夠穿過組織和細胞間隙進行運輸，進而被細胞內(nèi)吞、釋放所攜帶的外源基因。因納米基因載體可通過有效地保護外源基因來提高轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性，加之其毒性小、安全性高、無免疫原性，逐漸成為一類具有劃時代意義和創(chuàng)新性的高效動植物轉(zhuǎn)基因技術。

在國內(nèi)外的研究報道中，納米基因載體在煙草、玉米、擬南芥、洋蔥等中得以成功應用，其表現(xiàn)出的諸多優(yōu)點已受到研究人員的廣泛關注，同時，近年來其在動物基因工程改造中也取得了突破，為動植物基因轉(zhuǎn)化提供了一個新的、更有利的工具。通過采用分子自組裝技術、核殼納米顆粒的表面分子基團修飾技術等，篩選和構(gòu)建納米基因載體、傳輸和轉(zhuǎn)運外源基因，從而實現(xiàn)目的基因在靶標生物體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)化和表達，建立動植物細胞單基因及多基因高效轉(zhuǎn)化的基因載體輸送技術。此外，納米基因載體與其他轉(zhuǎn)基因方法具有極大的相容性，可將其與其他方法進行有效地結(jié)合，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，將會進一步擴大納米基因載體的應用領域。因此，本文對納米基因載體的種類、性質(zhì)及其在動植物基因工程中的應用進行了綜述，以期為動植物遺傳工程改造提供新思路。

1 納米基因載體的種類

利用生物兼容性材料制備而成的納米微囊或納米顆粒，可通過包裹或靜電吸附、化學鍵結(jié)合的方式偶聯(lián)外源DNA形成納米載體基因復合物[4]。納米基因載體目前主要分為3種類型：天然高分子生物材料、有機合成高分子材料和無機物材料[5]，具體特征見表1。

表1 納米基因載體的特征Table 1 The characteristics of nano-gene vectors.

1.1 天然高分子納米基因載體

天然高分子納米基因載體因具有良好的生物兼容性，以及可生物降解性和低免疫原性等優(yōu)勢，在基因治療中發(fā)展迅速，主要包括殼聚糖及其衍生物、淀粉、明膠、磷脂類、葡聚糖、瓊脂糖、纖維素及其衍生物以及血清白蛋白等，其中應用較多的是殼聚糖和淀粉。

殼聚糖(chitosan)是一種天然高分子氨基多糖聚合物，來源于甲殼動物或昆蟲的外骨骼，具有無毒、抗菌、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點，其最早應用于轉(zhuǎn)染外源基因到細胞中，可增強DNA的穩(wěn)定性，有效的保護核酸分子免受酶的降解。其優(yōu)勢在于主鏈上同時擁有氨基和羥基2種基團，可以設計成具有多種功能的載體，同時，具有良好的生物粘附性，可通過共價/離子交聯(lián)、疏水改性自組裝等方式得到殼聚糖基納米載體，且研究表明殼聚糖的基因轉(zhuǎn)染效率與其分子量相關[6]。郝麗娟等[7]利用共沉淀法制備了一種賴氨酸修飾的、殼聚糖包裹的磁性納米顆粒，該粒徑在100 nm左右，通過細胞生物實驗證明其細胞毒性較低，可與DNA結(jié)合且順利穿過血腦屏障，并具有良好的靶向性。

淀粉是一種天然高分子材料，廉價易得，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其應用較為廣泛，既可用于制備藥物載體，也可用于制備納米基因載體。Shiba等[8]利用可生物降解的淀粉微球(degradable starch microsphere，DSM)作為栓塞材料與腺病素載體，對肝癌小鼠進行肝動脈注射，得到了更高的基因轉(zhuǎn)染效率和更好的腫瘤靶向性，這是由于DSMs被血清淀粉酶降解后變得更小，在體內(nèi)15～30 min后完全溶解，促使載體更長時間的滯留進而提高基因的傳遞效率。其中，關于利用多聚賴氨酸修飾的淀粉納米顆粒基因載體的研究較多，其既可降低載體的毒性，又可融合多聚賴氨酸的細胞粘附性和陽離子特性，進而提高靶向性[9]。肖蘇堯等[9]利用反向微乳液法制備了陰離子淀粉納米顆粒，使其便于與帶正電荷的多聚賴氨酸結(jié)合，并利用正負電荷間的吸引力提高了對DNA分子的吸附率和洗脫率。此外，研究表明，通過在淀粉顆粒表面偶聯(lián)具有腫瘤靶向性的葉酸分子，可增強裝載藥物(阿霉素)的靶向性能，進而提高對肝癌細胞生長抑制的效果[10]。

1.2 有機合成的高分子納米基因載體

由于有機合成的高分子材料的合成和制備相對容易，且其具有可規(guī)?；a(chǎn)、易于表面修飾的優(yōu)勢，近年來在生物醫(yī)藥領域的應用較為廣泛。常用的有機合成高分子材料包括樹枝狀高分子聚合物(dendrimers)、聚乙烯亞胺(polyethylenim，PEI)、多聚賴氨酸(poly-L-lysines，PLL)、聚(β-氨基酯)[poly (β-amino esters)，PBAE]等。

樹枝狀高分子聚合物是一種直徑在1～13 nm的新型納米級合成高分子，具有均一、精確的空間構(gòu)造，由于表面附有大量的氨基基團，帶正電荷，可與帶負電的DNA結(jié)合，研究發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)染效率與其分支化程度有著密切關系。此外，其具有良好的分散性和生物相容性，細胞毒性低，表面修飾改性能力強。Haensler和Szoka[11]研究發(fā)現(xiàn)利用樹枝狀高分子聚合物構(gòu)建的基因載體在多種動物細胞系(尤其是哺乳動物的腫瘤細胞系)中，均有較高的轉(zhuǎn)染效率。Waite等[12]利用PAMAW樹枝狀高分子聚合物與醋酸酐反應得到乙酰化的樹枝狀大分子，其可與siRNA形成復合體，而這種復合體可降低人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87的細胞毒性。

聚乙烯亞胺(PEI)是一種多聚物納米載體，也是最有效的、應用最廣泛的非病毒載體之一，因其表面帶有大量的正電荷，可與帶負電荷的DNA通過靜電相互作用形成基因載體復合物，所以有較強的吸附DNA的能力；PEI還可將質(zhì)粒DNA包裹于其內(nèi)部，通過胞吞作用進入細胞，實現(xiàn)外源DNA的高效跨膜傳輸；并可以保護DNA分子避免被溶酶體水解，同時增強其從核內(nèi)體的釋放能力，從而提高轉(zhuǎn)化效率[13]。高分子量PEI(≥25 kDa)與低分子量PEI(≤2 kDa)相比，雖然具有更高的轉(zhuǎn)染能力，但毒性也更強，因此，如何兼顧轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性是后續(xù)研究的重點；另一方面，PEI/DNA復合體的穩(wěn)定性可隨著親水性的增強而增強，但是這也降低了其穿透細胞膜的能力，因此，PEI的修飾也成為研究的重點[13]。研究表明，將低分子量的PEI與P123(一種聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物)交聯(lián)進而與R13(一種具有2種官能團的多肽)進行偶聯(lián)，可以提高聚合物的靶向性和細胞攝取能力，而P123-PEI-R13/DNA復合體被細胞攝取后，在內(nèi)含體-溶酶體的酸化作用下再將DNA釋放出來[14]。

多聚賴氨酸(PLL)是一種陽離子多肽，具有生物可降解性，其表面帶正電荷的氨基基團可與帶負電荷的外源DNA分子發(fā)生靜電相互作用，進而形成基因載體復合物，但是其與DNA形成的復合物無法從內(nèi)含體中快速釋放出來，導致DNA有效轉(zhuǎn)移量少、轉(zhuǎn)染效率低，而將PLL與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)連接形成聚陽離子復合物膠束，與未經(jīng)修飾的PLL相比，降低了對細胞的毒性作用，同時，增強了其與DNA結(jié)合的能力，增加了復合物納米基因載體在水中的溶解性，從而提高了基因轉(zhuǎn)染效率[15]。

1.3 無機物材料

利用無機材料構(gòu)建功能性納米載體的研究頗多，其中，關于利用Fe3O4構(gòu)建磁性納米基因載體的研究最多，無機納米載體可在水溶液中通過共沉淀或氧化共沉淀制備，操作簡單，還可根據(jù)反應條件調(diào)節(jié)納米顆粒的粒徑大小(從幾十到幾百nm不等)、形狀和組成[16]。此外，無機納米載體還具有諸多優(yōu)點：生物親和性好、免疫排斥反應低、降解后毒副反應小，可有效保護DNA免受核酸酶的降解等。

Fe3O4磁性納米顆粒具有超順磁性，將其與外源基因結(jié)合制備成磁性納米基因載體，在外加磁場的驅(qū)動下，可靶向輸送外源基因，還能加快納米基因載體復合物的沉降速度，進而提高基因轉(zhuǎn)染效率[17]。但是，F(xiàn)e3O4納米顆粒的易聚集、生物兼容性差的屬性在一定程度上阻礙了其應用。而用殼聚糖對Fe3O4納米顆粒進行修飾，可發(fā)揮殼聚糖的惰性、親水性和生物相容性，與Fe3O4納米顆粒形成優(yōu)勢互補[18]。

硅納米粒子是一種惰性材料，在體內(nèi)幾乎無毒性，生物相容性好，表面易于修飾。研究發(fā)現(xiàn)，用二價陽離子對硅納米顆粒進行表面修飾后再與DNA結(jié)合，可以抵抗內(nèi)源性酶的溶解作用[19]；此外，F(xiàn)u等[20]利用帶正電荷的改性多聚賴氨酸(PLL)對二氧化硅納米顆粒進行修飾，結(jié)合基因槍法，成功將質(zhì)粒編碼的β-GUS基因?qū)霟煵葜参镏?，提高了轉(zhuǎn)化效率并使其得以穩(wěn)定遺傳。

2 納米基因載體的性質(zhì)

納米載體一般是指由高分子聚合物或無機材料制備而成的處于納米尺度的基因載體，其粒徑為10～1 000 nm，體積極小，所以具有極強的生物膜穿透能力。根據(jù)制備材料和結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為納米微囊載體和納米微球載體，二者的主要區(qū)別在于，前者是將外源基因包裹于高分子脂質(zhì)材料形成的外殼中，而后者是將外源基因散布于高分子基質(zhì)骨架中[21]。余東升等[22]早在2004年就利用乳化溶劑蒸發(fā)法制備了粒徑約為70 nm的DNA/聚乙二醇-聚谷氨酸兩嵌段共聚物納米微球，其生物相容性好、無毒、轉(zhuǎn)基因能力強，且對質(zhì)粒DNA具有很好的保護作用。納米載體粒徑極小，使得比表面積增大，從而產(chǎn)生一定的表面效應和體積效應，而且表面具有大量的不飽和懸空鍵，使得納米載體的化學活性更高[23]。在其表面修飾、改性以及偶聯(lián)一些特異性的靶向基團后，可吸附目的基因或者將目的基因包裹于內(nèi)部，形成的納米基因載體復合物與細胞表面受體通過靜電相互作用或化學鍵的方式偶聯(lián)結(jié)合，通過細胞胞吞作用遞送至細胞內(nèi)，釋放目的基因，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的目的。

與傳統(tǒng)型載體、病毒型載體相比，納米基因載體具有顯著的優(yōu)勢：①納米基因載體粒徑極小、比表面積大、穿透性強，故能穿過生物膜屏障，有效地提高了基因轉(zhuǎn)化效率；②納米基因載體是非病毒載體，自身無毒或者低毒，無免疫原性，生物相容性好，大多不會引起靶細胞的凋亡或機體的免疫排斥反應；③納米載體通過對表面進行化學基團的修飾，可偶聯(lián)具有特定功能的抗體或基團，極大地提高了外源基因傳輸?shù)陌邢蛐?；④納米基因載體對外源基因具有一定的保護作用，可以保護外源基因免受溶酶體的破壞，進而提高了轉(zhuǎn)染效率；⑤用于制備納米基因載體的材料來源豐富、價格低廉、種類繁多，且制備工藝簡單。

3 納米基因載體在動植物基因工程中的應用

動植物基因工程是農(nóng)業(yè)生物技術領域中研究最活躍的分支之一，利用基因轉(zhuǎn)染技術將外源基因?qū)雱又参矬w內(nèi)，對農(nóng)作物及家禽家畜等進行品種改良，目前已取得一定的突破。如環(huán)保型轉(zhuǎn)基因家畜的研發(fā)，減少了畜禽的糞便所引起的農(nóng)業(yè)污染，有利于環(huán)境保護；具有抗病、抗蟲、耐除草劑等優(yōu)良高品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物相繼研發(fā)成功，不僅增加了農(nóng)作物的產(chǎn)量，而且減少了因農(nóng)藥、化肥的使用而引起的環(huán)境污染。將外源基因?qū)胧荏w細胞是動植物基因工程改造的關鍵性技術，基因的成功導入需要安全、穩(wěn)定、高效的基因載體系統(tǒng)。Bally等[24]歸納了與基因轉(zhuǎn)染相關的生物障礙，提出將外源基因安全、有效地導入靶細胞的關鍵問題是發(fā)展安全、高效的基因載體系統(tǒng)，使其發(fā)揮相應的生物學功能。大量研究結(jié)果表明，以采用生物相容性材料與分子自組裝技術制備的納米顆粒作為基因載體，標記、輸送和轉(zhuǎn)運外源基因到動植物細胞內(nèi)部實現(xiàn)轉(zhuǎn)化與表達，是一種非常有前途的基因工程方法，因此，建立安全、有效的基因轉(zhuǎn)染方法，并使目的基因高效表達，已成為目前眾多研究領域的難點與熱點。

3.1 基于納米基因載體的植物轉(zhuǎn)化

近年來，轉(zhuǎn)基因技術在植物性狀改良的研究中得到了廣泛應用，并成功培育出一批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病、耐鹽堿等優(yōu)良性狀的農(nóng)作物新品種，極大地提高了經(jīng)濟效益。轉(zhuǎn)基因技術無需改變作物原有的其他特性，即可有目的、有計劃的引入優(yōu)良性狀，定向改良品種，打破了常規(guī)雜交育種的瓶頸，實現(xiàn)了品質(zhì)和產(chǎn)量的同步改良，促進了轉(zhuǎn)基因植物及其商業(yè)化的規(guī)模化發(fā)展。同時，隨著轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展，用于轉(zhuǎn)化的目的基因趨于多樣化，如品質(zhì)改良、抗病、抗逆等。因此，發(fā)展快速、簡單的轉(zhuǎn)化方法以開發(fā)具有新性狀的轉(zhuǎn)基因植物是現(xiàn)代植物改良計劃的重要研究內(nèi)容。

3.1.1傳統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化方法分析 基因遺傳轉(zhuǎn)化是實現(xiàn)植物基因工程研究的核心部分，在過去的30年中已經(jīng)發(fā)展了大量的基因轉(zhuǎn)染技術，可將控制特定功能性狀的基因(包括目的基因片段、質(zhì)粒DNA及植株總DNA)引入作物中，并穩(wěn)定地遺傳給后代。其中，植物常用的基因遺傳轉(zhuǎn)化方法主要分為2類：基于組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法和非組培轉(zhuǎn)化方法。

基于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法主要依賴于植物細胞的全能性，在無菌且適宜植物生長的環(huán)境(溫度、濕度、光照等)條件下，將植物的離體器官、組織、細胞或去壁的原生質(zhì)體，培養(yǎng)于含有植物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)劑等的合成培養(yǎng)基上，使其不斷生長分化并成長為完整植株[25]。農(nóng)桿菌介導法和基因槍法是植物遺傳轉(zhuǎn)化中較為常用的傳統(tǒng)方法，農(nóng)桿菌介導法的主要優(yōu)點是成本低、外源基因拷貝數(shù)低、遺傳穩(wěn)定性好，且轉(zhuǎn)化理論和技術操作比較成熟，是迄今為止植物遺傳轉(zhuǎn)化中應用最多的介導轉(zhuǎn)化方法[26]。而基因槍法不受受體基因型的影響，具有受體類型和靶受體類型廣泛等優(yōu)點，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用也較多[27,28]。但是這些方法均存在轉(zhuǎn)化周期長等缺點，利用農(nóng)桿菌介導法或基因槍法將外源基因?qū)胫参锖?，均需通過繁瑣的、長周期的組織培養(yǎng)過程，尤其是一些作物品種(如棉花和大豆)組織再生困難，嚴重影響了遺傳轉(zhuǎn)化的進程。因此，發(fā)展一種簡單、快速的植物轉(zhuǎn)化新方法用以克服離體培養(yǎng)、組織再生及相關問題，將有利于突破品種的特異限制，在降低成本的同時，實現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化過程的高效、簡便。

而非組培轉(zhuǎn)化方法中較為成功的是花粉管通道法?；ǚ垡蚱滟Y源豐富、易處理等優(yōu)點，是將外源基因引入生殖細胞系的理想靶標，而經(jīng)處理的花粉或花粉管可以吸收外源DNA，也為花粉介導植物遺傳轉(zhuǎn)化提供了可能[29～31]。花粉管通道法和花粉介導法均不需要植物組織培養(yǎng)或者再生過程，為組織再生困難的植物開辟了新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑[32]。此類基因傳輸方法需先將外源基因?qū)氲交ǚ鄣纳臣毎谢螂S著花粉管的生長被攜帶進入胚珠，再通過植物的受精過程自然發(fā)育獲得轉(zhuǎn)基因種子[33]。非組培轉(zhuǎn)化方法簡化了植物的轉(zhuǎn)化過程，可以在較短的周期內(nèi)得到轉(zhuǎn)基因植物，同時解決了棉花等離體再生系統(tǒng)不完善的植物的自交系不易轉(zhuǎn)化等問題，對于植物性狀改良具有重要意義[34]。

3.1.2納米基因載體與非組培轉(zhuǎn)化結(jié)合 將納米基因載體與花粉管通道法結(jié)合的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術，可提高外源基因在花粉管通道中的傳輸，并保護外源基因在傳輸和轉(zhuǎn)導過程中免受DNA酶的破壞，進而提高轉(zhuǎn)化效率。趙翔[35]利用花粉管通道法分別將與磁性納米載體偶聯(lián)的含有BtCpti殺蟲基因的表達載體及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棉花，并利用原位動態(tài)成像檢測技術，實時檢測納米載體基因傳輸過程，結(jié)果表明，在適合的磁場條件下，磁性納米載體可以提高轉(zhuǎn)化效率，同時該研究也對花粉管通道法機理進行了深入研究。

而將納米基因載體與花粉介導法相結(jié)合也是目前比較有效的一種轉(zhuǎn)基因方法，花粉介導法是指以植物花粉為受體材料，將外源DNA導入花粉后，通過花粉授粉直接得到轉(zhuǎn)基因種子的方法[36]。通常由于花粉粒具有較厚的細胞壁，用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法很難將外源基因?qū)氲匠墒斓幕ǚ壑?，并且萌發(fā)的花粉粒會釋放核酸酶，嚴重阻礙了外源基因的成功導入和整合。目前，研究中將目的基因?qū)牖ǚ鄞蠖嗍墙柚姄?、超聲或基因槍法等物理手段以及采用農(nóng)桿菌侵染花粉等[30,37～39]，但都會不同程度地對花粉結(jié)構(gòu)、功能完整性造成破壞，且存在操作難度大、偶然系數(shù)高、轉(zhuǎn)染效率低等問題[40]。而納米基因載體裝載容量大，對外源基因具有保護、靶向輸送和高效介導的功能，并且具有高度的生物相容性與安全性，將納米基因載體輸送技術與花粉介導技術相結(jié)合，有利于開發(fā)構(gòu)建植物多基因高效轉(zhuǎn)化的新技術[41]。

而此類多基因高效轉(zhuǎn)化新技術的特點包括：①納米基因載體粒徑小、穿透性強，有利于在操作條件溫和、對花粉無機械損傷的情況下，攜帶外源基因透過植物花粉表面結(jié)構(gòu)進入到花粉中，從而提高轉(zhuǎn)染花粉的成功率；②納米載體基因裝載量大，通過將DNA分子吸附濃縮在表面，可以將完整的大片段基因全部導入到花粉細胞的基因組中；③選擇適當?shù)募{米粒子作為外殼材料包裹基因片段，可以在將外源基因傳輸至花粉的過程中，保護DNA免受花粉粒釋放的核酸酶的降解，進而提高轉(zhuǎn)化效率；④可直接獲得轉(zhuǎn)染目的基因的植物種子和植株，避免了組織培養(yǎng)等繁瑣的操作過程，從而極大地縮短了遺傳轉(zhuǎn)化的周期[40]。

3.1.3納米基因載體應用 2007年，Torney等[42]利用二氧化硅(SiO2)納米粒子裝載外源基因穿過植物細胞壁，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，這是首次利用納米技術進行植物基因轉(zhuǎn)化，也是首次將納米技術這一新型工具帶入到植物學領域。而Zhao等[43]將磁性納米顆粒與外源DNA結(jié)合，磁轉(zhuǎn)染棉花花粉，外源DNA被成功地整合到棉花植株中，且在后代中有效表達并穩(wěn)定遺傳。該方法快速、簡單，可進行多基因轉(zhuǎn)化，同時也為利用花粉磁轉(zhuǎn)染其他農(nóng)作物提供了理論基礎和實踐依據(jù)，促進了轉(zhuǎn)基因作物新品種的培育。

納米基因載體在植物細胞中進行轉(zhuǎn)化時，存在細胞壁這一天然屏障，將裸露DNA運載進入細胞需要借助于合適的載體和外力(如利用電擊法、超聲波空化效應等)來提高納米載體/DNA復合物進入細胞的數(shù)量。王鳳華等[44]利用電擊法直接在植物細胞壁上穿孔，結(jié)合Fe3O4磁性納米顆?？梢晕讲馜NA分子的功能，將外源基因?qū)胨緫腋〖毎摲椒缺Ｗo了DNA分子免受電擊、酶解的破壞，又提高了植物細胞的存活率。研究表明，以多聚賴氨酸修飾的淀粉納米粒子作為基因載體，將外源基因通過超聲波介導法轉(zhuǎn)入盾葉薯蕷細胞，可實現(xiàn)植物基因的遺傳轉(zhuǎn)化[45]。

宋瑜[46]基于不同納米載體材料制備了3種基因載體復合物(PEI/DNA、CS/DNA、polyMAG/DNA3)，在對擬南芥的原生質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)3種載體均可有效的連接DNA，并具有較好的穩(wěn)定性以及保護DNA免受酶切的能力。因此，針對植物遺傳轉(zhuǎn)化的特定要求，設計制備適合的納米基因載體，構(gòu)建適用于植物轉(zhuǎn)化的新型、高效、靶向性基因載體，將是研究人員實現(xiàn)研發(fā)新的遺傳供體材料的新方法。

3.2 基于納米基因載體的動物轉(zhuǎn)化

3.2.1動物遺傳轉(zhuǎn)化方法分析 在過去的30年中，轉(zhuǎn)基因技術在動物遺傳育種和新品種選育的研究中取得了實質(zhì)性的進展。動物細胞基因轉(zhuǎn)染主要使用病毒載體法[47]以及非病毒載體法中的顯微注射法[48,49]等傳統(tǒng)技術。由于病毒型載體轉(zhuǎn)染效率相對較高，使用較多，但存在裝載容量小、有細胞毒性、可誘導宿主免疫反應等問題[50]。而近年來出現(xiàn)的精原干細胞法[51]、RNA干擾介導的基因沉默[52]等都存在外源基因整合效率低、操作步驟繁瑣、偶然性與隨機性大、對儀器設備要求過高等弊端，限制了其在動物遺傳育種領域的廣泛應用[53]。納米材料與技術的發(fā)展為動物遺傳育種提供了新的思路，其中利用納米顆粒作為基因載體有許多優(yōu)良的特性[54]：體積小、穿透性強，轉(zhuǎn)染效率高，安全、低毒、無免疫原性，并對外源基因具有保護功能等。而通過在納米基因載體表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，識別并結(jié)合細胞表面的特異性受體，可實現(xiàn)精準、高效對靶。

3.2.2納米基因載體與其他動物遺傳育種方法結(jié)合 由于納米基因載體的基因裝載量大，并對外源DNA具有保護作用，在動物遺傳轉(zhuǎn)化中已經(jīng)取得了一定的成效，因此，利用納米基因載體將多種功能基因同時進行轉(zhuǎn)化，進一步篩選得到穩(wěn)定表達的細胞系，再結(jié)合動物遺傳育種中的體細胞克隆技術，將使優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動物新品種的培育前景更加廣闊[55]。

將納米基因載體和動物遺傳育種的精子載體法相結(jié)合，可以很好的發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，精子介導轉(zhuǎn)基因是基于精子細胞特有的結(jié)合、內(nèi)化外源DNA的自然屬性，通過受精作用將外源DNA轉(zhuǎn)入卵內(nèi)，成本低廉、操作難度小，不需要復雜昂貴的儀器，轉(zhuǎn)染效率高，而結(jié)合納米基因載體對外源DNA具有保護作用這一特性，可以成為一種新型高效的動物遺傳轉(zhuǎn)化育種新途徑。Wang等[56]將磁性納米載體與精子介導的基因轉(zhuǎn)染相結(jié)合，研發(fā)轉(zhuǎn)基因小鼠，在磁場作用下首次將裝載有外源質(zhì)粒DNA的Fe3O4磁性納米顆粒導入小鼠精子細胞，孵育完成受精，并獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。而吳斌[57]利用納米化的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物介導豬精子轉(zhuǎn)染pEGFP基因，通過體外受精將外源基因?qū)肼涯讣毎泻蟪晒Ρ磉_，提高了精子介導的基因轉(zhuǎn)染效率。研究報道，以PEI包被的磁性納米顆粒作為載體轉(zhuǎn)染精子后，再利用轉(zhuǎn)染的精子介導轉(zhuǎn)基因，可獲得目的基因(PID1)高表達的轉(zhuǎn)基因生物[58]。

3.2.3磁性納米顆粒在動物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用 Fe3O4磁性納米顆粒在基因治療中可以介導外源基因轉(zhuǎn)染人體細胞，并能實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的納米載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[59]，在很大程度上也應同樣適用于畜禽等動物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化。兩者的不同之處在于：基因治療是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，而動物遺傳轉(zhuǎn)化需要將攜帶目的基因的重組質(zhì)粒高效的整合到動物細胞核內(nèi)的染色體上使其具有遺傳性[60,61]。而通過在Fe3O4磁性納米顆粒表面修飾多聚賴氨酸、殼聚糖等，可進一步改善其生物相容性和分散穩(wěn)定性[62,63]。

磁性納米粒子廣泛存在于自然界中的生物體內(nèi)，如趨磁細菌等，但是量較少，因此，目前主要利用化學方法(如共沉淀法、微乳液法、超聲化學法、高溫分解法等)制備。結(jié)合磁性納米基因載體粒徑小、分布均勻、無毒、生物相容性好等優(yōu)點，以及Fe3O4磁性納米載體在人體細胞基因治療領域的研究實例，針對目前在動物遺傳育種中遇到的技術性問題，可利用其攻克傳統(tǒng)基因載體在寄主范圍、轉(zhuǎn)染效率、基因裝載容量等方面的缺點和局限性。

4 展望

將納米材料與基因轉(zhuǎn)染技術相結(jié)合，通過對其表面進行功能基團修飾和改性，構(gòu)建安全、穩(wěn)定、高效的納米基因載體，應用于動植物遺傳轉(zhuǎn)化研究，并探索納米基因載體轉(zhuǎn)染技術與動植物遺傳育種及其他傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法相結(jié)合的新途徑，優(yōu)勢互補、揚長避短，對攻克傳統(tǒng)基因載體的基因裝載量小、靶向性差、轉(zhuǎn)染效率低等缺點具有重要意義。而新型納米材料作為靶向基因載體在動植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用也將作為深入研究的方向，如可降解性多聚賴氨酸-聚乙烯亞胺-聚乙二醇、聚乙烯亞胺(PEI)修飾的四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒、聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體等復合載體以及氣溶膠新型納米載體。

相對于動物細胞而言，由于植物細胞具有細胞壁等結(jié)構(gòu)障礙，因此，納米基因載體在轉(zhuǎn)化植物細胞方面的研究進展更為緩慢。如傳統(tǒng)的花粉介導法無需組織培養(yǎng)過程，縮短了育種年限；受體材料不受基因型限制，來源廣泛；方法簡便、易掌握，無需復雜昂貴的儀器設備，可直接在田間進行操作，適合于大規(guī)模的農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化。而從基因工程改造和分子育種的角度，如何將外源基因高效地導入花粉或花粉管中，是成功得到轉(zhuǎn)基因植株的關鍵步驟，需不斷研發(fā)新的植物轉(zhuǎn)基因方法來簡化轉(zhuǎn)化程序、提高轉(zhuǎn)化效率。通過針對性地設計和構(gòu)建具有植物細胞靶向性的納米基因載體，優(yōu)化花粉介導法的轉(zhuǎn)化條件，標記、輸送和運轉(zhuǎn)外源基因轉(zhuǎn)化花粉，從而克服現(xiàn)有轉(zhuǎn)化方法中的基因裝載容量小、轉(zhuǎn)化效率低等缺點。此外，利用整體植株的生殖細胞進行轉(zhuǎn)化，可直接收獲轉(zhuǎn)基因植株，并針對轉(zhuǎn)基因植株的目標性狀進行定向篩選，能夠與轉(zhuǎn)基因育種直接結(jié)合，從而提高目的基因的轉(zhuǎn)導效率，縮短育種周期，這對于發(fā)展植物轉(zhuǎn)基因新方法、加速轉(zhuǎn)基因種質(zhì)材料的大規(guī)模制備和優(yōu)良新品種的培育進程具有重要意義。

將納米基因載體與動植物生殖細胞、原生質(zhì)體、花粉等受體材料結(jié)合，可進一步推動納米載體遺傳轉(zhuǎn)化技術的發(fā)展和應用。而基因能否有效地從溶酶體內(nèi)迅速逃離是影響基因轉(zhuǎn)移效率的關鍵步驟，且胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)粒DNA不被降解可能比基因從溶酶體內(nèi)逃離更能決定基因的轉(zhuǎn)移效率。因此，以納米顆粒作為基因載體，其與裝載的目的基因的分解程度和釋放速率是需要考慮的問題。

此外，納米材料對受體動植物細胞的影響、納米材料及其構(gòu)建的載體入胞機制等基礎理論問題迫切需要進一步闡明；入胞途徑的細胞生物學和生理生化過程需要進一步實證；而開發(fā)可定向輸送目的基因到特定細胞或細胞器的安全、高效的新載體，目的基因的高效釋放和功能激發(fā)等，將是未來一段時間內(nèi)納米生物技術研究的主要方向。