響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助酶法提取南五味子多糖工藝的研究

胡琴漢, 汪 偉, 羅應(yīng)彪, 杜 芳, 仰榴青, 趙 婷

江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

五味子是木蘭科植物五味子(Schisandrachinensis)的成熟干燥果實(shí)，根據(jù)分布的位置不同，可分為北五味子和南五味子(Kadsuralongipedunculata)，前者分布在我國東北和華北地區(qū)，后者分布在華中地區(qū)。五味子是一種常見的滋補(bǔ)性中藥，具有極高的藥用和食用價(jià)值，已被列入保健食品名單[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖作為五味子中主要的活性成分[4]，其含量較高，具有抗氧化[5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降低血糖[9]及保肝護(hù)肝[10]等多種生物活性，且對機(jī)體正常細(xì)胞和組織的毒性極小，是目前功能食品研究的熱點(diǎn)之一。但目前關(guān)于五味子提取純化、結(jié)構(gòu)及活性方面的研究多集中于北五味子，而對于南五味子的研究較少。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)水提法提取南五味子多糖，最終粗多糖得率可達(dá)到12.91%，糖含量高達(dá)36.37%[11]?？梢娔衔逦蹲拥亩嗵呛枯^為豐富，具有較好的研究和應(yīng)用價(jià)值。

目前關(guān)于多糖的提取方法有很多，包括熱水浸提法[12]、超聲波輔助提取法[13]、微波輔助提取法[14]和酶輔助提取法[15]等。但工業(yè)生產(chǎn)上多糖的提取主要以傳統(tǒng)的熱水浸提法為主，該法提取時(shí)間長、能耗高、產(chǎn)率低。因此，尋找新的適用于工業(yè)生產(chǎn)的有效提取方法成為當(dāng)前多糖研究的重點(diǎn)。超聲波輔助提取法利用超聲波強(qiáng)大的震蕩產(chǎn)生的空化作用破壞植物細(xì)胞壁，使植物有效成分?jǐn)U散到溶劑中以提高提取效率。酶輔助提取法利用特異性酶分解破壞植物細(xì)胞壁來提高提取效率。超聲波輔助酶法是結(jié)合超聲波法和酶法的一種新型的提取方法，已廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取。王彥平等[16]通過超聲波輔助酶法提取紫山藥多糖，提取時(shí)間僅需25 min，多糖產(chǎn)率達(dá)到9.83%，且所得多糖具有較好的抗氧化活性。與常規(guī)超聲波輔助提取法相比，該法提取多糖時(shí)間縮短66.7%，且產(chǎn)率略有提高[17]。鄒燁等[18]以中華鱉裙邊為原料，采用超聲波酶法輔助提取膠原蛋白，最終產(chǎn)率可達(dá)74.5%，比常規(guī)酶法提取產(chǎn)量提高了約14%，且提取的膠原蛋白熱穩(wěn)定性顯著高于常規(guī)酶法提取[19]?？梢?，超聲波輔助酶法能有效提高提取效率，降低能耗，縮短提取時(shí)間，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究基于超聲波輔助提取法和酶輔助提取法的優(yōu)點(diǎn)，采用超聲波輔助酶法提取南五味子多糖，并以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用響應(yīng)面分析法對南五味子多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期為南五味子多糖的深入研究和多糖產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)中五味子購于江蘇中興藥業(yè)有限公司，經(jīng)粉碎烘干后備用。

實(shí)驗(yàn)所用果膠酶與纖維素酶均為食品級(jí)，酶活力分別為：10 000 U/g 和50 000 U/g；95%乙醇，石油醚(60～90℃)和鹽酸等試劑均為分析純。

電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；數(shù)控恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)； 101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市英峪予華儀器廠)；DT5-1B低速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)； FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1材料的預(yù)處理 稱取100 g干燥五味子粉末于2 000 mL圓底燒瓶，加入500 mL石油醚(60～90℃)，70℃回流1 h，重復(fù)脫脂3次。脫脂后，南五味子于65℃烘干，備用。

1.2.2南五味子粗多糖的提取 稱取脫脂后南五味子粉末5 g于圓底燒瓶，加入適量蒸餾水和復(fù)合酶(纖維素酶：果膠酶=1∶1)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH在250 W超聲波下恒溫?zé)崴√囟〞r(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后取上清液，旋蒸至50 mL，加入4倍體積的95%乙醇，4℃過夜，5 000 r/min離心10 min，棄去上清得到粗多糖沉淀，沉淀經(jīng)揮醇、冷凍干燥后得到五味子粗多糖粉末，稱重并計(jì)算產(chǎn)率。

1.2.3單因素試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，將超聲波功率和料液比分別固定為250 W和1∶30。對提取溫度、提取時(shí)間、反應(yīng)pH和酶用量分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)溫度選取40℃、50℃、60℃、70℃和80℃ 5個(gè)水平；提取時(shí)間選取30 min、40 min、50 min、60 min和70 min 5個(gè)水平；反應(yīng)pH選取5個(gè)水平：3、4、5、6、7；酶的用量選取1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5% 6個(gè)水平。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，將影響多糖得率的3個(gè)主要因素(提取pH、提取溫度和提取時(shí)間)進(jìn)行組合，以粗多糖得率(Y)為響應(yīng)值，確定中心組合試驗(yàn)的因素與水平，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)來優(yōu)化南五味子多糖提取的工藝條件。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels of RSM design.

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助酶法提取南五味子多糖的單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.1.1提取pH對南五味子多糖得率的影響 在提取時(shí)間30 min，反應(yīng)溫度40℃，酶用量為1.0%的條件下，考察反應(yīng)pH對五味子多糖得率的影響。由圖1可知，多糖的提取效率隨pH先增大后減小，當(dāng)pH<5時(shí)，多糖得率隨pH上升而增加，當(dāng)pH=5時(shí)，多糖得率達(dá)到峰值為6.2%，當(dāng)pH>5后，多糖得率開始下降，這可能是因?yàn)閜H為5時(shí)酶的活性最高，有利于多糖的溶出[20]。因此本實(shí)驗(yàn)選取pH=5為最佳pH。

圖1 提取pH對南五味子多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of extraction pH on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.2提取溫度對南五味子多糖得率的影響

在提取時(shí)間30 min，反應(yīng)pH=5，酶用量為1.0%的條件下，考察反應(yīng)溫度對五味子多糖得率的影響。如圖2所示，多糖得率隨反應(yīng)溫度先升后降，在反應(yīng)溫度為60℃時(shí)達(dá)到峰值7.87%。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)加劇，反應(yīng)效率增加，且多糖的溶解度增加，故多糖得率也增加，但當(dāng)溫度過高時(shí)，酶的活性降低甚至失活，導(dǎo)致反應(yīng)效率下降，多糖提取得率下降。故選取60℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 提取溫度對南五味子多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.3復(fù)合酶用量對南五味子多糖得率的影響 在提取時(shí)間30 min，反應(yīng)pH=5，反應(yīng)溫度60℃的條件下，考察復(fù)合酶用量對五味子多糖得率的影響。如圖3所示，多糖得率隨酶用量的增加而升高，但增加速率逐漸降低，當(dāng)酶用量趨近3.0%時(shí)，多糖得率增加趨勢減緩。在酶的用量較低時(shí)，適當(dāng)增加酶的用量，能有效提高反應(yīng)速率。但當(dāng)酶含量過多時(shí)，由于底物濃度一定，多余的酶分子無法與底物結(jié)合，效率增加緩慢，故選取3.0%為最佳酶濃度。

圖3 復(fù)合酶用量對南五味子多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of the mount of compound enzyme on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.1.4提取時(shí)間對多糖得率的影響 在反應(yīng)pH=5，反應(yīng)溫度60℃，酶用量為3.0%的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間對五味子多糖得率的影響。如圖4所示當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加，多糖得率隨之增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過60 min時(shí)，多糖得率反而下降。可見在一定的提取時(shí)間內(nèi)，隨反應(yīng)時(shí)間越長，多糖得率越高，但當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí)，多糖會(huì)在高溫下產(chǎn)生水解或結(jié)構(gòu)變性導(dǎo)致得率下降，故選取60 min為最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對南五味子多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on yield of Kadsura longipedunculata polysaccharide.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲酶輔助提取南五味子多糖的工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響多糖得率的3個(gè)主要因素(提取pH、提取溫度和提取時(shí)間)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果見表2、表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM.

表3 得率的方差分析Table 3 The analysis of variance on yield.

以多糖得率為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，按照各因素對得率試驗(yàn)結(jié)果的影響因素進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，南五味子多糖得率為：Y=8.53-0.18A-0.63B+0.54C+0.062AB-0.017AC-0.085BC-0.70A2-1.09B2-0.52C2

由表3可知，三個(gè)影響因素提取pH(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)和三個(gè)二次項(xiàng)(A2、B2、C2)對南五味子多糖得率具有較顯著性影響(P<0.05)，而三個(gè)交互作用的影響不顯著。模型的F值為56.61(P<0.01)，說明模型顯著性極顯著。失擬誤差F值為0.34，P=0.815，說明檢驗(yàn)結(jié)果與模型計(jì)算結(jié)果沒有顯著性差異。該模型的R2=0.986 4，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，該模型RAdj2=0.969 0，進(jìn)一步證明該模型擬合程度較好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV值越低，模型的置信度越高，本實(shí)驗(yàn)的CV值為2.31%，說明模型方程能夠很好的反應(yīng)真實(shí)試驗(yàn)值。由上可知，該模型可用于超聲波輔助酶法提取南五味子多糖試驗(yàn)的理論預(yù)測。

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖(圖5,彩圖見圖版五)，考察擬合響應(yīng)面的形狀，分析提取溫度、提取時(shí)間、提取pH對南五味子多糖得率的影響。如圖5所示，三個(gè)因素對多糖的得率都有較顯著的影響，其中提取時(shí)間的影響最為顯著，曲面較陡；影響最小的是提取溫度。而三個(gè)等高線圖均為圓形，說明三個(gè)因素之間的交互作用較小。

圖5 提取pH、提取溫度、提取時(shí)間交互作用對南五味子多糖得率影響的響應(yīng)面圖(A、C、E)及等高線圖(B、D、F)Fig.5 Response surface map (A、C、E) and contour map (B、D、F) of interaction effect of pH, extraction temperature and extraction time on the yield.(彩圖見圖版五)

通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的得率回歸模型分析，超聲波輔助酶法提取南五味子多糖的最優(yōu)工藝條件為：提取pH為4.79，提取時(shí)間為65.89 min，提取溫度為56.81℃，復(fù)合酶用量3.0%。預(yù)測最佳得率為8.81%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法提取五味子多糖工藝的可靠性，根據(jù)預(yù)測最優(yōu)工藝及實(shí)驗(yàn)操作可行性，將優(yōu)化工藝參數(shù)調(diào)整為提取pH 4.8，提取時(shí)間66 min，提取溫度57℃，復(fù)合酶用量3.0%，料液比30 g/mL，超聲波250 W條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到多糖得率為8.73%。這與響應(yīng)面模型預(yù)測結(jié)果較為接近，說明該模型準(zhǔn)確可靠，適用于南五味子多糖的提取。

3 討論

本文采用超聲波輔助酶法提取南五味子多糖，按照Box-Benhnken 的中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以南五味子多糖得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化得到最優(yōu)的提取工藝條件：超聲波功率250 W、料液比30 g/mL、提取pH為4.8、提取溫度56℃、提取時(shí)間66 min、復(fù)合酶用量為3.0%。在最佳條件下多糖的得率為8.67%。目前國內(nèi)對五味子多糖的提取工藝多有研究，程振玉等[21]采用超聲波輔助酶法提取北五味子多糖，提取時(shí)間為2 h，北五味子多糖得率為10.54%。與之相比，本文提取時(shí)間僅為其46%，多糖得率達(dá)到其得率的83%，可見，本工藝在對多糖得率影響不大的前提下，可有效縮短提取時(shí)間。趙婷等[22]采用熱水浸提法提取北五味子多糖，提取時(shí)間為6 h，提取溫度為100℃，北五味子多糖得率為12.91%，與之相比，本文提取時(shí)間僅為其1/6，提取溫度降低了44%，多糖得率達(dá)到其得率的68%，可見，本工藝不僅大大縮短了提取時(shí)間，而且大幅度降低了多糖提取的能耗。蔣紅等[23]采用響應(yīng)面法優(yōu)化大葉南五味子多糖的提取工藝，得到的最佳條件為提取時(shí)間2.4 h，提取溫度95℃，粗多糖得率為4.6%。與之相比，本工藝提取時(shí)間減少了60%，提取溫度降低了41%，粗多糖得率提高近90%?？梢娤噍^于傳統(tǒng)方法，超聲波輔助酶法提取可大幅度降低提取溫度、節(jié)約能耗，并極大的減少提取時(shí)間，具有較好的應(yīng)用前景。該研究為進(jìn)一步深入研究南五味子多糖結(jié)構(gòu)和活性奠定了基礎(chǔ)，為多糖產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。