龔 宇, 李迎秋

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院, 廣州 510150；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣州 510275

SUMO化修飾是一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，隨著其參與的眾多功能被陸續(xù)闡明，相關(guān)研究越來越受到人們關(guān)注。然而由于SUMO化修飾的瞬時(shí)性，大多數(shù)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的SUMO化修飾很難被檢測(cè)，導(dǎo)致SUMO化修飾位點(diǎn)的準(zhǔn)確鑒定面臨很多困難，因此建立應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)(外)篩選SUMO化修飾靶蛋白的技術(shù)方法至關(guān)重要。

SUMO化修飾與泛素化修飾相似，也是一個(gè)可逆的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)過程。循環(huán)包括成熟、活化、結(jié)合、連接和解離等步驟；SUMO前體分子經(jīng)泛素相似蛋白加工酶或 SUMO 特異性蛋白酶切除C端短肽后成熟；成熟的SUMO由SUMO活化酶(Uba2/Aosl異源二聚體)通過ATP依賴的SUMO-腺苷酸中間體介導(dǎo)，與Uba2的半胱氨酸殘基通過硫酯鍵相連而活化；隨后，活化的SUMO通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)移至SUMO特異性結(jié)合酶即Ubc9的半胱氨酸殘基上，Ubc9將SUMO分子結(jié)合到靶蛋白完成SUMO化；SUMO連接酶識(shí)別底物，促進(jìn)某些靶蛋白的SUMO化；靶蛋白的去SUMO化是由SENP家族介導(dǎo)的，去SUMO化后SUMO分子重新進(jìn)入循環(huán)[1,2]。依據(jù)SUMO化修飾反應(yīng)過程的特點(diǎn)，Rainer Niedenthal研究團(tuán)隊(duì)提出了一種分析靶蛋白SUMO化修飾的新方法：UFDS系統(tǒng)(Ubc9 fusion-directed SUMOylation system)，即Ubc9融合介導(dǎo)的SUMO化修飾系統(tǒng)，通過融合表達(dá)SUMO結(jié)合酶Ubc9和靶蛋白來放大SUMO與靶蛋白的結(jié)合，從而使SUMO化修飾的靶蛋白量顯著增加，最終大大提高檢測(cè)靶蛋白SUMO化修飾的效率[3～5]。

本研究將應(yīng)用UFDS系統(tǒng)來檢測(cè)PKCθ的SUMO化修飾。我們構(gòu)建了帶FLAG標(biāo)簽的Ubc9-PKCθ的真核表達(dá)載體，獲得了Ubc9和PKCθ的融合表達(dá)產(chǎn)物，再利用免疫共沉淀和Western印跡檢測(cè)證明了Ubc9-PKCθ可以發(fā)生SUMO化修飾，進(jìn)一步通過點(diǎn)突變技術(shù)發(fā)掘了PKCθ上可能發(fā)生SUMO化修飾的關(guān)鍵位點(diǎn)，從而驗(yàn)證了UFDS系統(tǒng)是篩選SUMO化修飾靶蛋白的有效方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胚腎293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；pFLAG-CMV-2、pEF6/cMyc真核細(xì)胞表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；PfuUltraⅡFusion HS DNA polymerse、QuikChange 定點(diǎn)突變?cè)噭┖芯?gòu)自Stratagene 公司；各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA連接酶購(gòu)自New England公司；用于免疫共沉淀的PKCθ (610090)抗體購(gòu)自BD公司；用于Western印跡的cMyc (9E10)(sc-40)、 PKC θ (C-19)(sc-1875)抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司，F(xiàn)LAG M2(F3165)抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。引物序列見表1。

表1 本研究所用PCR引物序列Table 1 Primer secquence in this study.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1UFDS系統(tǒng)構(gòu)建 根據(jù)Rainer Niedenthal的方法構(gòu)建UFDS系統(tǒng)，即構(gòu)建Ubc9和PKCθ融合表達(dá)的載體，將PKCθ表達(dá)在Ubc9的C端：先將通過PCR擴(kuò)增的Ubc9的CDS連接到載體pFLAG-CMV2上，再將通過PCR擴(kuò)增的PKCθ的CDS連接到載體FLAG-Ubc9的下游，接著在293T細(xì)胞中表達(dá)帶FLAG標(biāo)簽的Ubc9-PKCθ。

①構(gòu)建FLAG-Ubc9真核表達(dá)載體：以Jurkat E6.1細(xì)胞總cDNA為模板擴(kuò)增人Ubc9 CDS的全長(zhǎng)序列，PCR反應(yīng)體系為：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)1 μL，上、下游Ubc9引物(100 ng/μL)各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足到50 μL(引物序列見表1)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，40次循環(huán)；72℃ 3 min，4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶；Ubc9的PCR純化產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ和BglⅡ酶切消化后，與事先制備好的同樣具有HindⅢ和BglⅡ粘性末端的pFLAG-M2質(zhì)粒載體連接，得到FLAG-Ubc9質(zhì)粒。

②構(gòu)建FLAG-Ubc9-PKCθ真核表達(dá)載體：以Jurkat E6.1細(xì)胞總cDNA為模板擴(kuò)增人PKCθ CDS的全長(zhǎng)序列，PCR反應(yīng)體系為：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L)1 μL，上、下游PKCθ引物(100 ng/μL，引物序列見表1)各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s，40次循環(huán)；72℃ 3 min，4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶；PKCθ的PCR純化產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ和BamHⅠ酶切消化后，與事先制備好的同樣具有KpnⅠ和BamHⅠ粘性末端的FLAG-Ubc9質(zhì)粒載體連接，最終得到FLAG-Ubc9-PKCθ質(zhì)粒。

1.2.2基因點(diǎn)突變重組質(zhì)粒構(gòu)建 參考Stratagene公司QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖胁僮髡f明。以野生型FLAG-Ubc9-PKCθ質(zhì)粒為模板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)PKCθ-K227R、PKCθ-K261R、PKCθ-K325R、PKCθ-K376R、PKCθ-K412R、PKCθ-K506R和PKCθ-K656R引物(引物序列見表1)，在PfuUltraⅡFusion HS DNA polymerse的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為：PfuULtra II Fusion HS DNA Polymerase 1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP(各10 mmol/L) 1 μL，上、下游引物(125 ng/μL) 各1 μL，DNA模板(20 ng/μL)2.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足到50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 30 s，55℃ 1 min，68℃ 1.5 min，20次循環(huán)；68℃ 10 min，4℃。為了增加陽(yáng)性克隆的檢出率，將擴(kuò)增結(jié)束后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶DpnⅠ消化，從而使原始模板DNA被消化，選擇性地保留突變DNA；DpnⅠ消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后通過氨芐抗性篩選陽(yáng)性克??；突變體最終由DNA測(cè)序加以驗(yàn)證。

1.2.3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h用含10%胎牛血清的無抗DMEM培養(yǎng)基將人胚腎293T細(xì)胞接種于6孔板中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)70%～80%的細(xì)胞密度為宜。用50 μL opti-MEMI稀釋1 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，室溫靜置5 min；期間用50 μL opti-MEMI稀釋1 μg質(zhì)粒，然后將上述兩種溶液混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板中；37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)4～6 h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基，24～48 h后回收細(xì)胞。

1.2.4免疫共沉淀和Western印跡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，裂解上清分為兩部分，一部分為全細(xì)胞裂解液，作為內(nèi)參，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)是否均一；一部分用作后續(xù)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，加入0.4～1 μg抗體(抗FLAG抗體或抗PKCθ抗體)，4℃轉(zhuǎn)動(dòng)結(jié)合過夜，再加入25～50 μL蛋白G瓊脂糖珠，4℃轉(zhuǎn)動(dòng)結(jié)合3 h；接著用細(xì)胞裂解液沖洗3次，每次15 000 r/min離心3 min，最后一次吸去上清，再加入等量的2×SDS加樣緩沖液，于95℃變性10 min，離心后取上清；進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h；加入用4%BSA以一定比例(1∶1 000～1∶2 500)稀釋的一抗(抗FLAG抗體、抗cMyc抗體或抗PKCθ抗體)，4℃輕搖過夜，TBST中洗膜3次，每次10 min；加入用5%脫脂奶粉以一定比例(1∶10 000～1∶50 000)稀釋的二抗，室溫輕搖1 h，TBST中洗膜3次，每次10 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色，X光膠片顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 UFDS系統(tǒng)及突變體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)Rainer Niedenthal的方法，通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建了FLAG-Ubc9-PKCθ表達(dá)質(zhì)粒，即UFDS系統(tǒng)。然后，應(yīng)用Abgent公司的在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)SUMO化修飾位點(diǎn)的軟件SUMOplotTM分析，發(fā)現(xiàn)PKCθ上有多個(gè)潛在的能與SUMO分子結(jié)合的賴氨酸(K)位點(diǎn)，其中預(yù)測(cè)分高于0.8的有7個(gè)：K325、K376、K412、K261、K506、K227和K656(表2)。利用Strategene公司的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit，設(shè)計(jì)特定的單點(diǎn)突變引物將該點(diǎn)的堿基A突變?yōu)镚(AAA/AAG→AGA/AGG)，從而該點(diǎn)編碼的賴氨酸突變?yōu)榫彼?K→R)；如圖1(彩圖見圖版六)所示，通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建單點(diǎn)突變的FLAG-Ubc9-PKCθ，在此基礎(chǔ)上依次再進(jìn)行單點(diǎn)突變，構(gòu)建兩點(diǎn)、三點(diǎn)、四點(diǎn)、五點(diǎn)或六點(diǎn)同時(shí)突變的FLAG-Ubc9-PKCθ；測(cè)序和序列比對(duì)的結(jié)果表明賴氨酸都突變成了精氨酸，F(xiàn)LAG-Ubc9-PKCθ缺失SUMO化修飾的突變體構(gòu)建成功。

表2 SUMOplotTM預(yù)測(cè)PKCθ潛在SUMO化修飾位點(diǎn)的得分表Table 2 The score table for potential sumoylation sites of PKCθ predicted by SUMOplotTM.

圖1 FLAG-Ubc9-PKCθ缺失SUMO化修飾突變體(K→R)的測(cè)序與比對(duì)結(jié)果Fig.1 Sequencing and alignment analysis of sumoylation deletion mutant (K→R) FLAG-Ubc9-PKCθ.

將野生型或缺失SUMO化修飾的突變型FLAG-Ubc9-PKCθ分別轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞蛋白并進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。結(jié)果顯示用抗FLAG抗體檢測(cè)到特異性蛋白條帶，大小約為100 kDa(Ubc9的分子量約為18 kDa，PKCθ的分子量約為82 kDa),說明野生型和缺失SUMO化修飾的突變型FLAG-Ubc9-PKCθ，即UFDS系統(tǒng)均在293T細(xì)胞中得到表達(dá)(圖2)。

圖2 野生型和缺失SUMO化修飾突變型FLAG-Ubc9-PKCθ的表達(dá)Fig.2 Expression of wild type and sumoylation deletion mutant FLAG-Ubc9-PKCθ.

2.2 應(yīng)用UFDS系統(tǒng)檢測(cè)PKCθ的SUMO化修飾

我們將野生型或SUMO化修飾的突變型FLAG-Ubc9-PKCθ和cMyc-SUMO1質(zhì)粒共同或分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞蛋白用抗FLAG抗體免疫沉淀，然后分別用抗cMyc抗體和抗FLAG抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

如圖3所示，當(dāng)FLAG-Ubc9-PKCθ與cMyc-SUMO1共轉(zhuǎn)時(shí)，有幾條遷移率較慢的條帶可被抗cMyc抗體和抗FLAG抗體同時(shí)識(shí)別，其中略高于175kDa的條帶最為明顯，其分子大小相當(dāng)于2個(gè)或3個(gè)cMyc-SUMO1(32.5kDa)和FLAG-Ubc9-PKCθ(100kDa)的兩者之和(泳道5)，而當(dāng)FLAG-Ubc9-PKCθ或cMyc-SUMO1單轉(zhuǎn)時(shí)并沒有相應(yīng)的共價(jià)結(jié)合的條帶出現(xiàn)(泳道1～2)，說明Ubc9-PKCθ能夠被SUMO1修飾，且可能存在多個(gè)修飾位點(diǎn)。

我們選擇的突變型是多個(gè)SUMO化修飾位點(diǎn)同時(shí)突變的FLAG-Ubc9-PKCθ：4KR(K261/325/376/412R)、5KR(K261/325/376/412/506R)、6KR-1(K227/261/325/376/412/506R和6KR-2(K261/325/376/412/506/656R)。如圖3、4所示，與野生型FLAG-Ubc9-PKCθ 相比，四點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，檢測(cè)到的與 SUMO1 結(jié)合的條帶有所減弱(圖3泳道5、6)，五點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，條帶減弱的程度更加明顯(圖3泳道5、7)，直到六點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，才檢測(cè)不到遷移率較慢的 SUMO 化修飾條帶(圖4泳道4～6)，再次說明Ubc9-PKCθ能夠被SUMO1修飾，且可能存在多個(gè)修飾位點(diǎn)。

圖3 野生型和四點(diǎn)、五點(diǎn)同時(shí)突變型Ubc9-PKCθ的SUMO化修飾Fig.3 Sumoylation of wild type, four-point and five-point mutant Ubc9-PKCθ.

圖4 野生型和兩種六點(diǎn)同時(shí)突變型Ubc9-PKCθ的SUMO化修飾Fig.4 Sumoylation of wild type and two types of six-point mutant Ubc9-PKCθ.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證UFDS系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果，一方面，本研究將去SUMO化酶FLAG-SENP1與或不與FLAG-Ubc9-PKCθ、cMyc-SUMO1共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞蛋白用抗PKCθ抗體免疫沉淀，然后分別用抗cMyc抗體和抗PKCθ抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)；如圖5所示，當(dāng)FLAG-SENP1與FLAG-Ubc9-PKCθ、cMyc-SUMO1共表達(dá)時(shí)，不能檢測(cè)到那條略高于175kDa的條帶，證明其確實(shí)是SUMO1修飾ubc9-PKCθ的條帶。另一方面，本研究在293T細(xì)胞中單轉(zhuǎn)或共轉(zhuǎn)野生型或六點(diǎn)同時(shí)突變型FLAG-PKCθ和cMyc-SUMO1，48 h后收集細(xì)胞蛋白用抗FLAG抗體免疫沉淀，然后分別用抗cMyc抗體和抗FLAG抗體進(jìn)行Western印跡檢測(cè)；如圖6所示，與野生型FLAG-PKCθ 相比，六點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，檢測(cè)不到遷移率較慢的 SUMO 化修飾條帶，說明PKCθ能夠被SUMO1修飾，且可能存在多個(gè)修飾位點(diǎn)，與UFDS系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果相符合。

圖5 SENP1導(dǎo)致Ubc9-PKCθ去SUMO化修飾Fig.5 SENP1 leading to desumoylation of Ubc9-PKCθ.

3 討論

作為一類重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾分子，SUMO被發(fā)現(xiàn)已有十余年時(shí)間，近些年關(guān)于SUMO化修飾的研究發(fā)展快速。SUMO對(duì)底物蛋白的修飾過程涉及一系列酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)：ATP存在時(shí)，SUMO首先被活化酶活化，隨后被轉(zhuǎn)移到結(jié)合酶Ubc9上，最后在連接酶的促進(jìn)下SUMO從Ubc9轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。與泛素化過程中存在有多個(gè)泛素結(jié)合酶不同，Ubc9是SUMO化過程中唯一的SUMO結(jié)合酶，具有足夠的直接將SUMO轉(zhuǎn)移到底物蛋白并修飾底物蛋白的能力[6]。并且，由于Ubc9和泛素的表面大多帶正電，SUMO的表面大部分為負(fù)電荷，故Ubc9不能與泛素結(jié)合，只能與SUMO結(jié)合，Ubc9對(duì)SUMO是特異的[7]。基于Ubc9的以上特點(diǎn)，我們分析，Rainer Niedenthal團(tuán)隊(duì)提出的UFDS系統(tǒng)是Ubc9融合表達(dá)介導(dǎo)的SUMO化修飾檢測(cè)系統(tǒng)，Ubc9與底物蛋白的融合表達(dá)能大大地增加SUMO轉(zhuǎn)移到底物蛋白并修飾底物蛋白的可能性，并且這種可能性只針對(duì)SUMO[3～5]，因此我們認(rèn)為UFDS系統(tǒng)作為檢測(cè)SUMO化修飾靶蛋白的方法是具有理論基礎(chǔ)的。

圖6 野生型和兩種六點(diǎn)同時(shí)突變型PKCθ的SUMO化修飾Fig.6 Sumoylation of wild type and two types of six-point mutant PKCθ.

PKCθ是免疫細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白激酶，已知其活性和功能能通過多個(gè)氨基酸位點(diǎn)可逆的磷酸化修飾來調(diào)節(jié)[8～13]。而PKCθ上有多個(gè)賴氨酸位點(diǎn)，通過已知的SUMO化修飾位點(diǎn)的特點(diǎn)及SUMO化修飾形式的共性，我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了PKCθ上可能的SUMO化修飾位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PKCθ上一共有15個(gè)賴氨酸可能是SUMO化修飾位點(diǎn)，其中有7個(gè)賴氨酸的評(píng)分都很高，均在0.8分以上，從預(yù)測(cè)位點(diǎn)數(shù)量和評(píng)分高低都提示PKCθ能被SUMO化修飾的可能性極大，因此我們選用PKCθ作為應(yīng)用UFDS系統(tǒng)檢測(cè)SUMO化修飾的靶蛋白。

UFDS系統(tǒng)與普通方法得出的結(jié)論一致，即PKCθ與或不與Ubc9融合表達(dá)都能檢測(cè)到被SUMO化修飾，說明UFDS系統(tǒng)檢測(cè)SUMO化修飾的可行性。在鑒定SUMO化修飾位點(diǎn)時(shí)，雖然UFDS系統(tǒng)與普通方法得出的結(jié)論一致，但普通方法中完全檢測(cè)不到六點(diǎn)突變的PKCθ與SUMO結(jié)合的條帶，而UFDS系統(tǒng)中依然能檢測(cè)到六點(diǎn)突變的PKCθ與SUMO結(jié)合的條帶，只是相較于野生型PKCθ與SUMO結(jié)合的條帶要顯著的減弱，說明UFDS系統(tǒng)鑒定SUMO化修飾位點(diǎn)的精確性不夠，我們分析，這可能是Ubc9的融合表達(dá)使PKCθ與內(nèi)源性SUMO的穩(wěn)定結(jié)合也放大了。因此，通過我們的驗(yàn)證可以得出結(jié)論，UFDS系統(tǒng)能使靶蛋白可能發(fā)生的 SUMO 化修飾更易檢測(cè)，但也有一定的缺陷，人為增強(qiáng)可能導(dǎo)致產(chǎn)生假陽(yáng)性及無法鑒定具體的修飾位點(diǎn)。UFDS系統(tǒng)為細(xì)胞內(nèi)(外)篩選SUMO化修飾靶蛋白提供了可行的技術(shù)手段，但尋求更加精確、更加完善的方法仍然迫在眉睫。