郭亞龍, 胡 暉, 王 強(qiáng), 劉紅芝

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 100193

花生是我國獨(dú)具優(yōu)勢的農(nóng)產(chǎn)品之一，我國花生的種植、加工和貿(mào)易量均居世界首位。目前，花生主要用于榨油，可產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——花生粕，而根據(jù)制油工藝不同又可將其分為高溫粕和低溫粕[1]。傳統(tǒng)高溫工藝制得的花生粕，因蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重，只能用作飼料[2]；而近年來通過低溫制油工藝得到的花生粕，蛋白質(zhì)變性程度較低，基本保持了其功能特性，具有更高的應(yīng)用價值和前景[3～5]。但與大豆粕相比，低溫花生粕的綜合利用和精深加工尚不充分，對其進(jìn)行開發(fā)利用可豐富花生蛋白制品的種類、提升產(chǎn)品附加值，有利于促進(jìn)花生產(chǎn)業(yè)長遠(yuǎn)、健康的發(fā)展。

豆腐是我國居民日常膳食中重要的蛋白質(zhì)來源，目前市場上銷售的豆腐產(chǎn)品主要是以大豆為原料制作而成的。然而，一方面，大豆豆腐具有的豆腥味使部分消費(fèi)者難以接受[6]；另一方面，近年來我國大豆產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，而豆腐及其他大豆制品的消費(fèi)需求卻在不斷增加，因此，拓展新的豆腐加工原料具有重要意義。

花生中油脂含量可達(dá)50%以上，而脂肪含量過高會導(dǎo)致以花生為原料制備的豆腐存在成型困難、口感油膩的問題，且花生蛋白凝膠性相對較差、熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，這也是以花生蛋白為原料制備豆腐產(chǎn)品的技術(shù)瓶頸。而低溫花生粕已去除了部分油脂，便于調(diào)節(jié)脂肪含量，更適合作為制備豆腐的原料。本團(tuán)隊前期已建立了一種以低溫花生粕為原料，結(jié)合TG和HTPC制備花生豆腐的新型加工工藝[6]。但對于原料的脂肪含量對豆腐凝膠形成和品質(zhì)的影響尚缺乏系統(tǒng)的研究，因此，本研究進(jìn)一步考察了不同花生粕脂肪含量對制得的花生豆腐品質(zhì)的影響，并且分析了加工過程中花生蛋白結(jié)構(gòu)的變化，以期為花生豆腐加工提供技術(shù)指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

魯花11脫皮花生購于山東玉皇糧油食品有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(酶活力為1 000 U/g)、Lowry法蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS)來自美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

QYZ-230液壓榨油機(jī)(山東省良君益友機(jī)械有限公司)；WSD-Y衛(wèi)生即時豆腐機(jī)(北京市洛克機(jī)械有限責(zé)任公司)；K1100凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；SOX406脂肪分析儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；TA-TX2i質(zhì)構(gòu)儀(英國Stable Micro System公司)；101A-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗儀器廠有限公司)；CS-580色彩色差計(杭州彩譜科技有限公司)；NANO DSC差示掃描量熱儀(美國TA Instruments公司)；UV2550紫外可見光分光光度計(日本島津公司)；F-2500熒光分光光度計(日本日立公司)。

1.3 不同脂肪含量花生粕制備

以魯花11為原料，先將其于95℃烘烤30 min，待冷卻后脫紅衣得到脫皮花生。再分別稱取3 kg脫皮花生，利用液壓榨油機(jī)(50℃，28～32 MPa)榨取5 min、10 min、20 min、60 min和180 min，得到不同脂肪含量的花生粕。于4℃冷庫中保藏備用。

1.4 物質(zhì)組成分析

蛋白質(zhì)的測定參照GB 5009.5-2016[7]方法進(jìn)行；脂肪的測定參照GB/T 5009.6-2016[8]方法進(jìn)行；固形物含量的測定采用105℃恒重法測定[9]。

1.5 花生豆腐制備工藝

參照Guo等[6]的方法制備花生豆腐。

1.6 豆腐品質(zhì)分析

1.6.1豆腐得率測定 參照Zuo等[10]的方法測定豆腐得率，即每100 g低溫花生粕制得豆腐的重量(g)，單位為g/100 g。

1.6.2豆腐保水性測定 參照Puppo等[11]的方法，稱取3 g(精確至0.001 g)豆腐于50 mL離心管中(底部放置一定量的脫脂棉)，1 000 r/min離心10 min，取出豆腐稱其質(zhì)量為m1，再于105℃條件下干燥3～5 h至恒重(m0)，按照下式計算豆腐保水性：

保水性=(m1-m0)/m1×100%

1.6.3豆腐質(zhì)構(gòu)測定 參照Guo等[6]的方法，利用TA-TX2i質(zhì)構(gòu)儀測定花生豆腐的硬度、彈性和咀嚼性。

1.6.4豆腐耐煮性測定 參照Chang等[13]的方法，將豆腐切成長方體小塊(3 cm×1.5 cm×1.5 cm)并稱其質(zhì)量為m1，放入盛有沸水的電磁爐中保持沸騰5 min，再將煮后的豆腐樣品過40目篩過濾，并準(zhǔn)確稱量篩上豆腐質(zhì)量m2。按照下式計算豆腐蒸煮損失：

蒸煮損失=(m1-m2)/m1×100%

1.6.5豆腐色澤分析 參照Kong等[14]的方法，采用色彩色差計的CIELAB顏色空間測定豆腐色澤，用L、a、b值表示。L(0～100)代表亮度值，接近0代表偏向黑值，接近100代表偏向白值；a(+，-)代表紅綠值，+代表偏向紅值，-代表偏向綠值；b(+，-)代表黃藍(lán)值，+代表偏向黃值，-代表偏向藍(lán)值。儀器用標(biāo)準(zhǔn)盤(L*=89.73，a*=-0.78，b*= 1.88)平衡，每個樣品測定6次，計算L、a、b的平均值。

1.7 花生蛋白結(jié)構(gòu)變化表征

1.7.1熱特性分析 參照Guo等[6]的方法，利用NANO DSC測定花生蛋白樣品的變性溫度(Td)和吸熱焓值(ΔH)。

1.7.2表面疏水性測定 參照He等[15]的方法，以8-苯胺-1-萘磺酸銨鹽(ANS)為熒光探針測定表面疏水性(H0)。熒光分光光度計的發(fā)射波長和激發(fā)波長分別設(shè)為470 nm和390 nm。H0即為熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖而得的斜率。

1.7.3總游離巰基含量測定 參照Ou等[16]和Gong等[17]的方法測定總游離巰基含量。配置pH 8.0含8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液。稱取180 mg花生蛋白樣品，并與10 mL無水丙酮混合攪拌10 min，3 719 r/min離心10 min，所得沉淀用5 mL丙酮洗滌2次，再用氮吹儀除去殘余丙酮。加入緩沖液將沉淀溶解、攪拌30 min，6 790 r/min離心10 min，收集上清液待測。取4 mL上清液與160 μL的Ellman’s試劑(4 mg/mL)混勻，反應(yīng)10 min，于412 nm處測定吸光度。以不含花生蛋白樣品的溶液作為參比。根據(jù)下式計算總游離巰基含量：

總游離巰基含量(-SH，μmol/g)=(75.53×A412)/C

其中，A表示在412 nm處的吸光度，C表示蛋白濃度(mg/mL)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SSPS 16.0和Origin 8.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan’s檢驗判定顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料組成分析

如表1所示，脫皮花生中蛋白質(zhì)含量和脂肪含量分別為27.49%和45.81%，隨著壓榨時間增加(5～180 min)，油脂從花生中被擠出，使得花生粕中脂肪含量降低(從25.54%到6.89%)，與此同時蛋白質(zhì)含量增加(從35.45%到43.33%)，且制漿后所得的花生乳中蛋白質(zhì)含量也隨之增加(從3.61%到4.31%)。但花生乳中固形物含量卻表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，花生經(jīng)過短時間壓榨(5 min、10 min、20 min)獲得的脂肪含量較高、蛋白質(zhì)含量較低的樣品制得的花生乳，其固形物含量總體上高于以長時間壓榨(60 min、180 min)樣品制得的花生乳。一般而言，豆?jié){中固形物含量隨著大豆中蛋白質(zhì)含量的增加而增加[18]，產(chǎn)生本研究實(shí)驗結(jié)果的原因可能是，前者在壓榨過程中蛋白質(zhì)受壓力作用時間較短、變性程度較低，有利于在浸泡、磨漿過程中溶脹并轉(zhuǎn)移至花生乳中；而后者經(jīng)過長時間壓榨后，蛋白質(zhì)變性程度較高，不利于其溶出。

表1 原料物質(zhì)組成分析Table 1 Composition analysis of raw materials.

2.2 脂肪含量對豆腐質(zhì)構(gòu)和保水性影響

如表2所示，當(dāng)花生粕的脂肪含量為6.89%時，豆腐硬度為275.44 g，咀嚼性為141.08 g，介于市售大豆石膏豆腐和鹵水豆腐之間，且接近于石膏豆腐；彈性為0.96，顯著高于(P<0.05)市售大豆石膏豆腐(0.95)和鹵水豆腐(0.91)。隨著脂肪含量增加(6.89%～15.43%)，花生粕和花生乳中蛋白質(zhì)含量相對減少(表1)，豆腐硬度和咀嚼性均呈降低趨勢，這與前人的研究結(jié)果一致[19,20]。而當(dāng)脂肪含量增加到20.28%時，豆腐硬度和咀嚼性顯著增加(P<0.05)，但仍小于脂肪含量為6.89%的花生粕制得的豆腐?？傮w上，當(dāng)脂肪含量在10.12%～20.28%范圍內(nèi)時，所得豆腐的質(zhì)構(gòu)較之于市售大豆豆腐偏軟。而當(dāng)脂肪含量過高(25.54%)時，難以壓制成型。豆腐得率和保水性均隨花生粕脂肪含量增加而呈先升高后降低趨勢，而且花生豆腐的保水性均高于市售大豆豆腐。

表2 不同花生粕脂肪含量對豆腐得率、保水性和質(zhì)構(gòu)影響Table 2 Yield, water holding capacity and textural properties of tofu prepared from peanut cakes with different oil contents.

2.3 豆腐品質(zhì)分析

2.3.1耐煮性分析 分析了以脂肪含量為6.89%的花生粕為原料制得的花生豆腐的耐煮性，并與市售大豆鹵水豆腐和石膏豆腐進(jìn)行了對比(圖1)。結(jié)果顯示，在沸水中保持沸騰5 min后，

圖1 花生豆腐蒸煮損失Fig.1 Cooking loss of peanut tofu.

花生豆腐蒸煮損失率為0.89%，而市售鹵水豆腐和石膏豆腐的蒸煮損失率分別為0.69%和0.25%，雖然三者之間有顯著差異(P<0.05)，但數(shù)值均較小，這表明采用新型工藝制得的花生豆腐具有優(yōu)良的耐煮性。

2.3.2色澤分析 分析了以脂肪含量為6.89%的花生粕為原料制得的花生豆腐的色澤，并與市售大豆鹵水豆腐和石膏豆腐進(jìn)行了對比(表3)。結(jié)果表明，花生豆腐L值為87.39，而市售鹵水豆腐、石膏豆腐分別為89.11、90.06，雖然三者在數(shù)值上具有顯著性差異(P<0.05)，但花生豆腐仍呈現(xiàn)出較好的亮度；花生豆腐a值為負(fù)(-0.32)，偏向綠值，而市售鹵水豆腐、石膏豆腐a值均為正，偏向紅值；3種豆腐b值均為正，說明在黃藍(lán)值中偏向黃值，但是花生豆腐b值(8.38)顯著小于市售大豆鹵水(16.56)和石膏(15.86)豆腐(P<0.05)，表明大豆豆腐色澤偏黃。綜上可以看出，花生豆腐顏色亮白，具有一定的色澤優(yōu)勢。

表3 花生豆腐色澤分析Table 3 Color analysis of peanut tofu.

2.4 脂肪含量對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響

2.4.1蛋白質(zhì)熱特性分析 研究了加工過程中花生粕脂肪含量對蛋白質(zhì)熱特性的影響。表4中，Td可反映球蛋白的熱穩(wěn)定性，Td值高通常表示蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性強(qiáng)[21]；而ΔH則與未變性蛋白質(zhì)比例或蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)程度有關(guān)[22]。花生乳粉樣品均有2個吸收峰，這分別對應(yīng)花生伴球蛋白和球蛋白組分的熱變性行為。隨著原料脂肪含量從6.89%增加到20.28%，初始花生乳粉的伴球蛋白的變性溫度Td從95.04℃逐漸降低到93.35℃，但當(dāng)脂肪含量為25.54%時，Td略有增加，為93.93℃；伴球蛋白的吸熱焓值(ΔH)隨脂肪含量增加呈降低趨勢。而對于球蛋白組分，其Td和ΔH呈現(xiàn)出與伴球蛋白相同的變化趨勢。

而經(jīng)TG處理的花生乳粉，交聯(lián)后伴球蛋白和球蛋白的Td和ΔH均在脂肪含量為6.89%時最大。對于伴球蛋白組分而言，除原料脂肪含量為6.89%的樣品Td值較處理前顯著增加(P<0.05)外，其他脂肪含量制得的樣品在經(jīng)TG處理后，Td值均呈減小趨勢，而各樣品中伴球蛋白的ΔH在經(jīng)TG處理后也均呈減小趨勢。對于球蛋白組分而言，TG處理增加了原料脂肪含量為6.89%和25.54%的樣品的Td值，降低了其他脂肪含量制得的樣品的Td值，而各樣品的ΔH在經(jīng)TG處理后均減小。

表4 加工過程中花生粕脂肪含量對蛋白熱特性影響Table 4 The effect of oil contents of peanut cakes on the thermal properties of peanut protein during tofu processing.

對于HTPC處理后所得的豆腐粉，原料脂肪含量為25.54%的樣品中花生蛋白典型的2個吸收峰消失，但又出現(xiàn)1個新的吸收峰，這說明HTPC處理未能使樣品中的蛋白質(zhì)完全變性(圖2)。而在其他脂肪含量制得的樣品中，花生蛋白典型的2個吸收峰消失后并未產(chǎn)生新的吸收峰，說明這些樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)HTPC處理后完全變性。這可能是由于脂肪含量過高影響了HTPC的作用效果。研究表明，豆腐中蛋白質(zhì)完全變性是形成豆腐凝膠的先決條件[23]，而原料脂肪含量為25.54%的樣品中的蛋白質(zhì)未能充分變性，也在一定程度上解釋了原料的脂肪含量過高難以制備花生豆腐的原因。

2.4.2蛋白質(zhì)表面疏水性分析 研究了豆腐加工過程中，經(jīng)TG和HTPC處理后，不同花生粕脂肪含量對花生蛋白表面疏水性的影響(圖3)。當(dāng)脂肪含量為6.89%時，花生乳蛋白表面疏水指數(shù)(H0)為105.99，隨著脂肪含量增加(10.12%、15.43%)，H0呈減小趨勢，分別為103.84、96.64，但繼續(xù)增加脂肪含量，H0基本保持平緩。由于花生乳中蛋白質(zhì)均未經(jīng)處理，這種差異可能主要是樣品中蛋白質(zhì)含量不同造成的，對于脂肪含量較高的樣品，其蛋白質(zhì)含量相對較小(表1)，導(dǎo)致測定的表面疏水性數(shù)值較低。

經(jīng)TG處理后，在不同脂肪含量下，交聯(lián)花生蛋白的表面疏水性均顯著低于相應(yīng)的花生乳蛋白(P<0.05)，這可能是因為TG交聯(lián)使蛋白質(zhì)的表面區(qū)域減小，從而限制了疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)的表面[24, 25]。但是在不同脂肪含量下，表面疏水性降低的幅度不同，當(dāng)脂肪含量為6.89%時，表面疏水性降低幅度較高，為44.04%，而當(dāng)脂肪含量為25.54%時，降低幅度最低，為26.07%。這表明脂肪含量過高會抑制TG的作用效果。

圖2 HTPC處理后不同花生粕脂肪含量制得的豆腐粉熱流曲線Fig.2 Thermal analysis of peanut tofu powers with different oil contents after HTPC treatment.

圖3 加工過程中花生粕脂肪含量對花生蛋白表面疏水性(H0)影響Fig.3 The effect of oil contents of peanut cakes on the surface hydrophobicity (H0) of peanut protein during tofu processing.

進(jìn)一步施加HTPC處理后，在各脂肪含量下，所得豆腐粉中的蛋白質(zhì)的表面疏水性都進(jìn)一步降低，這表明蛋白質(zhì)分子間形成了疏水相互作用。同樣地，不同脂肪含量對表面疏水性降低的幅度有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)脂肪含量為6.89%時，降低幅度較高，為60.09%，說明形成了較強(qiáng)的疏水相互作用；而當(dāng)脂肪含量為25.54%時，降低幅度最低，為14.81%，說明形成的疏水相互作用較弱。這也在一定程度上解釋了脂肪含量過高時，難以制備花生豆腐的實(shí)驗現(xiàn)象(表2)。

2.4.3蛋白質(zhì)總游離巰基含量分析 研究了豆腐加工過程中，經(jīng)TG和HTPC處理后，不同脂肪含量對花生蛋白總游離巰基含量的影響(圖4)。當(dāng)脂肪含量為6.89%時，花生乳蛋白總游離巰基含量為9.53 μmol/g，當(dāng)脂肪含量為10.12%、15.43%時，總游離巰基含量有微小增加，分別為9.72 μmol/g、9.89 μmol/g。而當(dāng)脂肪含量增加到20.28%、25.54%時，總游離巰基含量顯著降低(P<0.05)，分別為7.32 μmol/g、6.69 μmol/g。不同花生粕脂肪含量制得的花生乳中的蛋白質(zhì)總游離巰基含量的差異主要是蛋白質(zhì)相對含量不同引起的。

圖4 加工過程中花生粕脂肪含量對花生蛋白總游離巰基含量影響Fig.4 The effect of oil contents of peanut cakes on the total free sulphydryl content of peanut protein during tofu processing.

經(jīng)TG處理后，在不同脂肪含量下，交聯(lián)花生蛋白的總游離巰基含量均呈增加趨勢。這可能是因為TG處理使花生蛋白發(fā)生部分變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)初步打開，暴露出更多的游離巰基[12]。施加HTPC處理后，總游離巰基含量顯著降低(P<0.05)，這表明蛋白質(zhì)分子間形成了二硫鍵。同樣地，總游離巰基含量變化的幅度也受到脂肪含量的影響。當(dāng)脂肪含量過高(25.54%)時，經(jīng)TG處理后，該樣品的總游離巰基含量增加幅度最小，而經(jīng)HTPC處理后，其降低也最少，這進(jìn)一步證實(shí)了過量的脂肪會抑制TG和HTPC的作用效果，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的打開，以及二硫鍵的形成。

3 討論

低溫花生粕作為一種營養(yǎng)、功能兼具的重要蛋白質(zhì)資源，將其加工成花生豆腐產(chǎn)品，不僅可以拓展低溫花生粕的應(yīng)用范圍，也有利于豐富花生制品和豆腐制品的種類。脂肪作為豆腐加工原料中的重要組分，可影響蛋白質(zhì)的凝膠作用，且對豆腐產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和感官品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。一般認(rèn)為，在豆腐加工過程中，脂肪包被在豆腐凝膠網(wǎng)絡(luò)中，起到改善豆腐質(zhì)構(gòu)的作用[26]。Murekatete等[27]分別以大豆和大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)為原料制備豆腐，發(fā)現(xiàn)與SPI豆腐相比，以大豆為原料制得的豆腐具有更小的網(wǎng)孔、更均一密實(shí)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Shin等[12]以2種不同脂肪含量的豆粉為原料制備豆腐，結(jié)果表明全脂豆腐比低脂豆腐具有更優(yōu)的質(zhì)構(gòu)和更低的脫水收縮率。

長期以來，由于花生豆腐制備工藝不成熟、研究相對較少，花生的脂肪含量對花生豆腐品質(zhì)的影響也未見研究報道。本研究以低溫花生粕為原料，結(jié)合TG和HTPC工藝處理制備花生豆腐，研究了花生粕脂肪含量對豆腐品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，花生粕脂肪含量對豆腐品質(zhì)的影響較大，當(dāng)脂肪含量為6.89%時，制得的豆腐質(zhì)構(gòu)良好(與市售石膏豆腐質(zhì)構(gòu)接近)，這主要是因為脂肪填充在凝膠網(wǎng)絡(luò)空隙起到改善質(zhì)構(gòu)的作用[28]，但脂肪含量過高(25.54%)時，難以壓制成型，這可能是由于過量的脂肪會阻礙蛋白質(zhì)分子之間相互作用形成凝膠網(wǎng)絡(luò)[29]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明，在適當(dāng)?shù)闹竞?6.89%～20.28%)下，HTPC處理可使花生蛋白完全變性，最終通過疏水相互作用和二硫鍵維持豆腐凝膠結(jié)構(gòu)；而過多脂肪的存在則會干擾TG的作用效果以及煮漿過程中蛋白質(zhì)的變性和相互作用，形成較弱的疏水相互作用和二硫鍵，從而解釋了花生粕脂肪含量較高時難以制備豆腐的原因。

本研究初步分析了花生粕脂肪含量對豆腐品質(zhì)的影響及加工過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，可為花生豆腐的加工提供一定的指導(dǎo)和借鑒。然而，脂肪對豆腐品質(zhì)的影響機(jī)制尚不清晰，有待借助更先進(jìn)的研究手段來表征豆腐加工過程中脂肪與蛋白質(zhì)的相互作用情況，以便更深入地理解脂肪在豆腐凝膠形成中的作用。