李華杰, 徐雄峰, 邱 波

武漢大學人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科, 武漢 430060

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種非造血組織的多能干細胞，具有多向分化潛能、旁分泌效應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、遷徙趨化等特性，在軟骨修復、傷口愈合、肝臟再生等領(lǐng)域都證實了其治療作用，被視為組織工程中的種子細胞[1～3]。MSCs來源廣泛，可以從多種組織中分離獲取[4]，而要達到臨床移植的細胞數(shù)量級，體外擴增是不可或缺的步驟。然而，研究顯示原代MSCs經(jīng)常規(guī)體外培養(yǎng)擴增后遷徙能力迅速下降，移植生物體后，靶向組織中的MSCs檢出率較低，治療效果難以達到預(yù)期[5]，而以MSCs移植為基礎(chǔ)的治療效應(yīng)，很大程度要依賴其向組織損傷部位的靶向遷徙作用。越來越多的學者認為，微環(huán)境的改變是MSCs常規(guī)培養(yǎng)擴增后各種原始特性衰退的重要原因，因此亟須尋找更加成熟高效的MSCs體外培養(yǎng)方法，從而能夠有效維持MSCs遷徙趨化等原始特性，加強MSCs治療作用的發(fā)揮[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)相比，三維多細胞球狀體可以更好地模擬真實的體內(nèi)環(huán)境，三維成球培養(yǎng)體系可顯著促進MSCs的生物活性，表現(xiàn)出更強的治療潛力[7,8]。因此，球體形成方法成為干細胞研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，現(xiàn)已研發(fā)了數(shù)種獲得MSCs球體的三維培養(yǎng)方法，包括懸滴法、非黏附材料表面法、旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法和微流體系統(tǒng)等。盡管上述方法均可制備MSCs球體，但仍存在局限性，例如，使用懸滴技術(shù)可以收獲較為均一的細胞球體，但由于懸滴體積的限制，球體的平均尺寸相對較小，制備的球體產(chǎn)量也較低；旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法獲得的細胞球體，尺寸大小可以通過旋轉(zhuǎn)速度操控，然而需要特制設(shè)備，旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的層流也可能損傷細胞本身；非黏附材料表面雖可制備大量球體，球體的尺寸較難控制；通過微流體系生產(chǎn)的細胞球體難以收集進行后續(xù)操作[9]。近年發(fā)現(xiàn)將殼聚糖材料制備為培養(yǎng)底物，可誘導MSCs自發(fā)組裝為3D球體，之前的研究證實這種成球培養(yǎng)對MSCs干性基因表達具有顯著的促進作用[10]。本文將進一步探討這種生物膜成球培養(yǎng)對MSCs遷徙趨化能力的影響，并探討其相關(guān)機制，以期提高MSCs的移植效率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼聚糖粉末購自國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Corning公司；熒光定量PCR儀購自上海宏石醫(yī)療器械有限公司；SYBR GREEN PCR Master Mix(熒光定量PCR預(yù)混液)、RNA提取試劑盒及超微量分光光度計購自美國賽默飛公司；PCR引物購自武漢谷歌生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；實驗所用臍帶標本取自武漢大學人民醫(yī)院婦產(chǎn)科一分娩后健康產(chǎn)婦，產(chǎn)婦及家屬對臍帶用于實驗研究均知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 CS底物制備

將1%的殼聚糖溶液(溶液含1%冰醋酸)均勻涂布于六孔培養(yǎng)板底部，1.2 mL/孔。置于65℃烘箱24 h烘干液體，制成CS薄膜底物。細胞實驗前將六孔板在紫外線下暴露過夜，CS底物經(jīng)0.5 mol/L NaOH溶液中和處理10 min，用無菌水充分洗去堿液殘余，然后PBS沖洗后進行后續(xù)操作[10]。

1.3 原代臍帶間充質(zhì)干細胞的分離提取

用含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的PBS溶液充分洗滌臍帶，用鑷子從臍帶的中間分開華氏膠組織，將所得組織充分剪碎至1 mm3大小,加入低糖DMEM培養(yǎng)液置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10% 胎牛血清，培養(yǎng)5～7 d后，可見有部分細胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈細小的梭形，一周后，細胞開始迅速增殖，形成大小不等的細胞集落，待細胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，換用5%胎牛血清低糖DMED培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。從形態(tài)學和流式細胞儀分析鑒定這些細胞為MSCs，以P1代細胞作為種子細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組及細胞培養(yǎng)

將獲得的MSCs P1代細胞以3×105/孔接種實驗組六孔板，即底部覆蓋CS薄膜的六孔板；同樣密度接種于普通六孔板，作為對照組。兩種培養(yǎng)方式均使用含5% 胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱。觀察細胞形態(tài)，接種72 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.5 細胞劃痕實驗

消化并收集兩組細胞種植于六孔培養(yǎng)板，待細胞融合度接近80%用200 μL槍頭平行劃線，PBS洗去散落細胞，換用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選取5個觀察點顯微鏡拍照記錄，Image J 軟件處理圖片，分析48 h劃痕區(qū)域愈合情況，實驗重復3次。

1.6 Transwell法檢測細胞遷徙

收集細胞并計數(shù)，用DMEM無血清培養(yǎng)基稀釋細胞至2.5×105個/mL，將500 μL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基預(yù)先加入24孔板中，并將Transwell小室(8 μm)置于24孔板中，上室加200 μL的細胞懸液，置37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱，分別于24 h、48 h后取出小室，用10 mmol/L PBS清洗2遍，棉簽擦拭上室中的細胞，95%乙醇固定30 min，0.2%結(jié)晶紫染色15 min，PBS再次清洗，顯微鏡選取5個視野，計數(shù)細胞，實驗重復3次。

1.7 RT-PCR測定遷徙相關(guān)基因mRNA表達水平

采用Real-time PCR方法檢測實驗組和對照組培養(yǎng)MSCs遷徙相關(guān)基因(CXCR4、CXCR7、MCP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2)的表達水平。收集培養(yǎng)72 h的兩組細胞，提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL cDNA作為PCR擴增模板，使用GAPDH作為內(nèi)參基因。用SYBR GREEN PCR Master Mix在PCR儀定量分析。采用2-ΔΔCt法分析PCR結(jié)果，將對照組基因表達量進行歸一化處理，用柱形圖表示實驗組mRNA相對表達倍數(shù)，RT-PCR引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS V22.0統(tǒng)計學分析軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數(shù)±標準差表示，采用Students’t-檢驗進行兩樣本均數(shù)差異顯著性分析，P<0.05定義為顯著性差異。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Sequences of Real-time PCR primers.

2 結(jié)果與分析

2.1 臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察

如圖1(彩圖見圖版三)所示，接種于常規(guī)聚苯乙烯平板表面培養(yǎng)后，MSCs表現(xiàn)為類成纖維細胞形態(tài)的貼壁細胞，增殖后聚集成簇，而CS作為底物的培養(yǎng)條件下，MSCs類似懸浮生長狀態(tài)，單個細胞的體積明顯較小，MSCs在CS表面自發(fā)聚集為球狀體，并進行性增大，球團之間也存在再融合趨勢。

2.2 劃痕實驗檢測實驗細胞遷徙能力

選取5個觀察點，記錄實驗組及對照組48 h內(nèi)劃痕區(qū)域內(nèi)細胞遷移情況(圖2，彩圖見圖版三)，經(jīng)Image J軟件分析愈合率結(jié)果(圖3)顯示，與對照組相比，實驗組劃痕間區(qū)域愈合速率較快，差異有極顯著統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。說明殼聚糖薄膜培養(yǎng)組MSCs具有更為活躍的體外遷徙能力。

圖1 兩種培養(yǎng)方式中MSCs的形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of MSCs in two groups.(彩圖見圖版三)

圖2 劃痕實驗檢測MSCs 遷徙能力Fig.2 Migration activity of MSCs measured by wound healing assay.(彩圖見圖版三)

圖3 劃痕實驗中兩組MSCs劃痕區(qū)域愈合率對比Fig.3 Comparison of healing rate in two groups by wound healing assa.

2.3 Transwell小室遷徙實驗

倒置顯微鏡下對各組穿膜細胞數(shù)計數(shù)如圖4(彩圖見圖版三)、圖5所示：24 h時，對照組穿膜細胞數(shù)8.80±2.18，實驗組為14.80±2.05；48 h時對照組穿膜細胞數(shù)11.20±1.79，實驗組為21.60±1.87，經(jīng)SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析，兩組之間差異有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)，說明殼聚糖薄膜培養(yǎng)顯著促進了MSCs的趨化特性。

2.4 Real-time PCR檢測遷徙相關(guān)基因的表達水平

采用Real-time PCR方法檢測兩種方式培養(yǎng)的MSCs遷徙趨化相關(guān)基因表達，結(jié)果分析顯示，CS培養(yǎng)組MSC球體中趨化因子MCP-1，趨化因子受體CXCR4、CXCR7，以及基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2等基因表達水平顯著上調(diào)，CS組mRNA相對表達倍數(shù)如圖6所示。說明殼聚糖薄膜成球培養(yǎng)顯著上調(diào)了MSCs中遷徙趨化相關(guān)基因的表達。

圖5 24 h和48 h時兩組MSCs在Transwell實驗中穿膜細胞數(shù)比較Fig.5 Comparison of cell numbers in two groups by Transwell assay at 24 h and 48 h

圖6 CS培養(yǎng)組MSCs遷徙趨化相關(guān)基因mRNA相對表達倍數(shù)Fig.6 The relative expression multiple of mRNA from genes about migration and chemokines of MSCs in chitosan film culture group.

3 討論

眾所周知，MSCs具有修復替代功能，并可通過旁分泌效應(yīng)調(diào)節(jié)損傷部位的微環(huán)境[11]，刺激內(nèi)源性干細胞增殖，特定受損部位的遷徙細胞數(shù)目與MSCs發(fā)揮修復功能密切相關(guān)，如何提高MSCs移植后的遷徙效率越來越受到研究者的重視[12，13]。此前研究表明，CS成球培養(yǎng)可顯著促進MSCs干細胞特性，潛在機制可能涉及CS對MSCs的底物依賴性基因調(diào)控[14]。本文的細胞劃痕及Transwell遷徙實驗結(jié)果顯示，CS培養(yǎng)組細胞球體解離的MSCs具有更活躍的運動能力和更多的小室穿膜細胞數(shù)，證實了這種生物膜成球培養(yǎng)對MSCs的遷徙趨化特性的促進作用。

與其他球體培養(yǎng)方案一致，實驗中還觀察到CS成球培養(yǎng)中單個MSCs細胞體積較常規(guī)貼壁培養(yǎng)明顯偏小。有研究表明，MSCs常規(guī)擴增后靶向組織遷徙效率低下與其輸注生物體后發(fā)生的組織血管栓塞有密切關(guān)系，包括靜脈輸注后的肺部滯留和動脈輸注后的腦血管栓塞，而單個MSCs細胞的大小是影響栓塞的重要因素[15,16]；研究發(fā)現(xiàn)球體解離的MSCs體積較小，很大程度避免了動脈輸注后的腦血管栓塞現(xiàn)象，并增強了對腦梗死的治療效果[17]。這表明殼聚糖薄膜成球培養(yǎng)的小體積MSCs更有利于突破組織血管屏障，實現(xiàn)更為高效的遷徙作用。

此外，本文實驗進一步通過RT-PCR分析證實了CS成球培養(yǎng)對MSCs遷徙趨化基因的顯著影響。在各類損傷或炎癥模型中，趨化因子會局部高表達從而動員趨化性細胞靶向遷徙發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，MSCs遷徙效應(yīng)同樣與這種趨化作用密切相關(guān)[13]。研究表明，常規(guī)方式體外擴增后，MSCs表面的趨化因子受體表達迅速下降，嚴重削弱了靶向遷徙效應(yīng)[5]。本文研究結(jié)果表明CS成球培養(yǎng)對MSCs趨化相關(guān)基因CXCR4、CXCR7、MCP-1等基因表達具有不同程度的上調(diào)。趨化因子受體CXCR4、CXCR7在MSCs遷徙過程中均具有重要作用，且兩者存在串擾效應(yīng)[18]。尤其CXCR4在兩種培養(yǎng)方式下表達差異極顯著(接近50倍相對表達量)，SDF-1/CXCR4作為細胞遷徙中的主要趨化軸被廣泛研究，MSCs在受損組織中的募集也有賴于這條通路的激活，而通過CXCR4基因的過表達也實現(xiàn)了MSCs高效的靶向遷徙[19,20]。MCP-1作為趨化因子在MSCs歸巢中發(fā)揮重要作用[21]，其在MSCs中的高表達可能與趨化特性的維持存在關(guān)聯(lián)。

CS培養(yǎng)的MSCs 球體中MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2等表達水平的上調(diào)對于MSCs的遷徙趨化同樣具有重要意義。除了依靠遠程的趨化作用到達靶向組織，MSCs移植到生物體內(nèi)后還需要一定的組織屏障穿透能力，遷徙至損傷區(qū)域發(fā)揮修復作用，這個過程與MMP家族基因表達密切相關(guān)[22]。細胞遷徙過程中，需要通過MMP裂解組織基底膜，特別是MMP-2和MMP-9，其在降解膠原和明膠(基底膜的主要組分)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。研究表明，廣譜MMP抑制劑存在下，MSCs穿過基底膜的能力可被有效阻斷，MMP-1作為間質(zhì)膠原酶，在高遷移率MSCs中活性較強[24]；而MMP-2、TIMP-2基因的敲低，顯著降低了MSCs的遷徙能力[25]。此外，TGF-β1、IL-1β等炎性因子的干預(yù)可以顯著上調(diào)MSCs中MMP-2、MMP-9的表達，刺激MSCs的趨化性遷徙[25]；細胞外基質(zhì)的MMP水解產(chǎn)物對MSCs遷徙發(fā)揮介導作用[22]；MMP-2活性抑制可阻遏SDF1/CXCR4信號傳導，抑制MSCs遷移[26]。

值得注意的是，本文研究發(fā)現(xiàn)，CS薄膜培養(yǎng)的MSCs球體中趨化因子受體、MMP家族等相關(guān)檢測基因都呈現(xiàn)出不同程度的表達上調(diào)。很多研究通過基因修飾、化學處理、細胞因子干預(yù)、缺氧培養(yǎng)等手段強化某些基因在MSCs中的表達，從而實現(xiàn)對其遷徙效應(yīng)的促進作用[27～29]。然而，此類方法某種程度上忽略了常規(guī)貼壁培養(yǎng)環(huán)境與生物體內(nèi)MSCs原始生存微環(huán)境的巨大差異是造成MSCs原始特性衰退的重要原因；而球體培養(yǎng)方案展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，其模擬了MSCs團塊聚集的生長方式，提供了輕度缺氧微環(huán)境，緊密的細胞間接觸，ECM的立體包裹，使MSCs的生物活性整體得到了較好維持[30]。MSCs的遷徙機制較為復雜，我們的研究初步證實了CS成球培養(yǎng)對MSCs遷徙趨化特性的促進作用，仍需要進一步的深入探索。