高海濤 曲雁 張勛 穆俊晌 張璞 王欣 趙秀棉
聽力損傷為糖尿病常見并發(fā)癥之一,糖尿病引起的耳蝸微血管病變和神經(jīng)病變,可影響耳蝸毛細(xì)胞功能及聽神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)功能,是造成聽力損失的重要原因[1, 2]。研究表明白藜蘆醇具有舒張血管、改善血管內(nèi)皮功能、抑制血管炎癥反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化應(yīng)激、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用[3~5]。白藜蘆醇可通過降低血糖、血脂水平和抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)高表達(dá)而改善糖尿病視網(wǎng)膜血管的結(jié)構(gòu)和功能異常[6];白藜蘆醇還可抑制高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[7];而在高糖環(huán)境下,白藜蘆醇是否能減輕內(nèi)耳微血管損傷尚不清楚。本研究擬探討白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)耳損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 2月齡的健康Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只,體重250~300 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。不限食水,在12 h光照周期、溫度22~25 ℃、濕度65%的環(huán)境中飼養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為白藜蘆醇高、低劑量治療組,模型組及正常對(duì)照組,每組15只。
1.2糖尿病大鼠模型的建立 除正常對(duì)照組外,各組大鼠禁食24 h,以360 mg/kg的劑量給予所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,高、低劑量治療組及模型組大鼠以40 mg/kg的劑量經(jīng)股靜脈單次注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液建模,同時(shí)給予高脂飼料(北京博奧飼料公司)喂養(yǎng);對(duì)照組注射等量生理鹽水。高、低劑量治療組及模型組大鼠注藥后3 d檢測空腹血糖,以空腹血糖≥11 mmol/L為糖尿病模型建立成功。
1.3白藜蘆醇給藥劑量及方法 高、低劑量治療組每天分別以100、50 mg/kg的白藜蘆醇(美國Sigma公司)灌胃1次,對(duì)照組及模型組每天以等量的生理鹽水灌胃一次。各組均正常攝食、攝水,持續(xù)治療4個(gè)月。實(shí)驗(yàn)操作遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[8]有關(guān)規(guī)定,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施均經(jīng)過本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。
1.4聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)檢測 4個(gè)月的治療結(jié)束后隨機(jī)選取各組大鼠6只,水合氯醛麻醉,隔音屏蔽室內(nèi)檢測ABR閾值,記錄電極置于顱頂正中,參考電極和接地電極分別置于給聲耳及對(duì)側(cè)耳后的乳突部皮下,耳機(jī)放置在距外耳道 0.5 cm處。具體操作與設(shè)置參考劉宏偉等[9]使用的方法。
1.5血管通透性評(píng)價(jià) 完成ABR檢測后隨機(jī)選取各組大鼠4只,沿股靜脈注射0.02 mg/ml伊凡思藍(lán)(EB)0.2 ml,60 min后,沿心臟灌注0.9%生理鹽水200 ml,5 min內(nèi)灌注完畢。分離耳蝸,經(jīng)甲酰胺(1∶4)勻漿組織,勻漿的耳蝸組織在60 ℃下放置24 h,70 000 g離心45 min;檢測波長620 nm處的吸光度值,以此表示提取物中EB含量,以100 mg濕重的耳蝸組織中所含的EB含量表示內(nèi)耳血管通透性,EB含量越高,血管通透性越好。
1.6大鼠血糖、血脂及內(nèi)耳組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 治療結(jié)束后隨機(jī)選取各組大鼠4只,經(jīng)股靜脈采血2 ml,4 ℃,3 000 g離心10 min分離血漿備用;用酶-底物試劑盒(上海生物工程公司)檢測各組大鼠空腹血糖、血漿膽固醇及血漿甘油三酯水平(所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行)。采血后處死大鼠,分離耳蝸,充分勻漿,在60 ℃下放置24 h,70 000 g離心45 min后備用;丙二醛、過氧化氫、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶測試盒均購于南京建成生物工程研究所,嚴(yán)格根據(jù)說明書步驟進(jìn)行操作,檢測耳蝸組織中的丙二醛、過氧化氫、超氧化物歧化酶及過氧化氫酶含量。
1.7免疫組化檢測內(nèi)耳組織VEGF及細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)表達(dá) 治療結(jié)束后隨機(jī)選取各組大鼠3只,分離耳蝸組織后,脫鈣、脫水、石蠟包埋、超薄切片(厚度為4 μm)、脫蠟、入水沖洗,切片上依次滴加抗原修復(fù)液、山羊血清封閉液、一抗、生物素化二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,輔以0.1 MPBS沖洗,DAB顯色,水洗,蘇木素復(fù)染,再水洗、1%鹽酸酒精分化、1%胺水反藍(lán)、水洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明兩次、中性樹脂封片;顯微鏡下觀察VEGF、ICAM-1表達(dá)。
1.8Western blot檢測內(nèi)耳組織凋亡促進(jìn)因子caspase-3、Bax和凋亡抑制因子Bcl-2、VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá) 治療結(jié)束后,選取各組大鼠4只,分離耳蝸組織,充分裂解,BCA法檢測各樣品蛋白濃度;凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜,電化學(xué)發(fā)光液曝光,采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析;以目的蛋白與內(nèi)參tubulin的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)量,并以正常對(duì)照組作為對(duì)照檢測各組大鼠耳蝸組織中caspase-3、Bax、Bcl-2、VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)。caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自美國Abcam公司;VEGF、ICAM-1購自美國CST公司;BCA蛋白定量測定試劑盒、ECL發(fā)光液購自美國ThermoFisher Scientific公司。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 相關(guān)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料,計(jì)量資料組間比較采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1各組大鼠ABR檢測結(jié)果及內(nèi)耳血管通透性比較 模型組大鼠ABR閾值(63.56±4.11 dB SPL)顯著高于對(duì)照組(24.38±3.07 dB SPL) (P<0.05),與模型組比較,低、高劑量治療組大鼠ABR閾值(分別為45.34±3.81、43.62±4.75 dB SPL)均顯著下降。模型組內(nèi)耳EB含量(4.6±0.8 ng)顯著高于對(duì)照組(1.5±0.4 ng) (P<0.05),與模型組比較,低、高劑量治療組內(nèi)耳EB含量均明顯降低(分別為2.3±0.7 ng,2.1±0.6 ng)。
2.2各組大鼠血糖、血脂及內(nèi)耳組織氧化應(yīng)激水平(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛及過氧化氫含量)比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠的空腹血糖、血漿總膽固醇及血漿甘油三酯水平均顯著升高(均為P<0.05);白藜蘆醇干預(yù)后,高、低劑量治療組大鼠的空腹血糖、血漿總膽固醇及血漿甘油三酯水平均明顯低于模型組(均為P<0.05) (表1)。
與對(duì)照組比較,模型組大鼠內(nèi)耳組織的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平明顯降低(均P<0.05),丙二醛和過氧化氫水平則明顯上升(均P<0.05);白藜蘆醇干預(yù)后,高、低劑量治療組大鼠內(nèi)耳組織的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平均顯著高于模型組(均P<0.05),丙二醛和過氧化氫水平則顯著低于模型組(均P<0.05) (表1)。
表1 各組大鼠血糖、血脂及內(nèi)耳組織超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛及過氧化氫含量比較±s)
注:#與對(duì)照組比較,P<0.05;*與模型組比較,P<0.05;△與低劑量治療組比較,P<0.05。
2.3各組大鼠內(nèi)耳組織VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)比較 各組內(nèi)耳組織中VEGF、ICAM-1蛋白陽性表達(dá)均呈棕黃色顆粒狀,主要分布在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中,見圖1。與對(duì)照組比較,模型組大鼠耳蝸組織的VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(均為P<0.05);白藜蘆醇干預(yù)后,高、低劑量治療組的VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)水平與模型組比較均顯著降低(均為P<0.05) (圖2,表2)。
2.4各組內(nèi)耳組織凋亡促進(jìn)因子caspase-3、Bax和凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,模型組大鼠耳蝸組織的caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(均P<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);白藜蘆醇干預(yù)后,高、低劑量治療組的caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平與模型組比較均顯著下調(diào)(均為P<0.05),Bcl-2表達(dá)則顯著升高(P<0.05) (圖3,表3)。
糖尿病對(duì)聽覺系統(tǒng)的影響可引起漸進(jìn)性雙側(cè)對(duì)稱性感音神經(jīng)性聾,患者可出現(xiàn)耳蝸、神經(jīng)傳導(dǎo)通路甚至是腦干異常,聽力損失機(jī)制涉及微血管病變、神經(jīng)病變等[10, 11]。糖尿病微血管病變表現(xiàn)為耳蝸血管基底膜增厚、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、透明變性等[11]。另外,長期高血糖可使神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生病理生理變化,導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜低氧、氧化應(yīng)激及神經(jīng)營養(yǎng)減少[2]。本研究結(jié)果顯示模型組及高、低劑量白藜蘆醇治療組大鼠ABR反應(yīng)閾均較對(duì)照組明顯升高,提示糖尿病大鼠聽功能受到損傷;且模型組內(nèi)耳血管通透性較對(duì)照組增強(qiáng),內(nèi)耳組織超氧化物歧化酶、過氧化氫酶較對(duì)照組明顯降低,丙二醛、過氧化氫較對(duì)照組明顯升高,提示糖尿病大鼠內(nèi)耳組織氧化應(yīng)激水平升高。
研究表明,白藜蘆醇可改善高脂飲食誘發(fā)的代謝性疾病癥狀[12],還可改善糖尿病血管病變,抗氧化應(yīng)激、減少低密度脂蛋白氧化[13];但未見白藜蘆醇在糖尿病內(nèi)耳損傷發(fā)生中的作用的研究。從本研究結(jié)果看,高、低劑量治療組大鼠內(nèi)耳EB含量明顯低于模型組,ABR反應(yīng)閾明顯低于模型組,提示白藜蘆醇可抑制高糖環(huán)境誘導(dǎo)的聽力損傷及減弱內(nèi)耳血管通透性,機(jī)制可能與其降低血糖、血脂水平及抑制氧化應(yīng)激和血管通透因子VEGF有關(guān);白藜蘆醇可減輕糖尿病缺血缺氧誘發(fā)的氧化應(yīng)激和炎癥損傷[14],為本研究結(jié)果提供支持;另外,文中結(jié)果顯示高、低劑量白藜蘆醇對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)耳損傷的保護(hù)作用沒有顯著差異。
圖1 各組大鼠耳蝸組織螺旋神經(jīng)節(jié)VEGF和ICAM-1表達(dá)(免疫組化×200)
圖2 Western blot檢測各組大鼠耳蝸組織VEGF和ICAM-1表達(dá)
表2 各組大鼠耳蝸組織VEGF、ICAM-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平±s)
注:#與對(duì)照組比較,P<0.05;*與模型組比較,P<0.05。
圖3 Western blot檢測大鼠耳蝸組織caspase-3, Bax及Bcl-2表達(dá)
表3 大鼠耳蝸組織caspase-3, Bax及Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平±s)
注:#與對(duì)照組比較,P<0.05;*與模型組比較,P<0.05。
VEGF又稱血管通透因子,能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖,增加血管通透性,改變細(xì)胞外基質(zhì),還可促進(jìn)黏附分子如ICAM-1表達(dá)[15]。ICAM-1是在細(xì)胞表面表達(dá)的介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的糖蛋白,在機(jī)體炎癥與免疫應(yīng)答,傷口修復(fù),凝血與血栓形成等病理過程中扮演重要角色[16]。文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇能通過下調(diào)VEGF表達(dá)減輕低壓低氧誘發(fā)的急性腦水腫[17],其衍生物還可抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)[18]。本研究結(jié)果顯示,使用高、低劑量白藜蘆醇治療后,高、低劑量治療組大鼠內(nèi)耳組織中VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組,且兩治療組的ABR反應(yīng)閾也明顯低于模型組,說明白藜蘆醇可能通過抑制糖尿病大鼠耳蝸組織VEGF、ICAM-1的表達(dá),緩解聽功能損傷。
文獻(xiàn)報(bào)道2型糖尿病患者和糖尿病動(dòng)物模型均表現(xiàn)為耳蝸血管紋基底膜明顯增厚,耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管紋內(nèi)皮細(xì)胞明顯缺失[19, 20]。研究表明白藜蘆醇可抑制PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[21],還可通過抑制細(xì)胞凋亡延緩內(nèi)皮細(xì)胞自然衰老[22]。本研究檢測了糖尿病模型大鼠耳蝸組織凋亡促進(jìn)因子caspase-3、Bax及凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,糖尿病大鼠耳蝸組織caspase-3、Bax表達(dá)增多,Bcl-2表達(dá)減少,且應(yīng)用白藜蘆醇干預(yù)后兩治療組內(nèi)耳的caspase-3,Bax表達(dá)較模型組明顯下調(diào)(P<0.05),Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05),提示白藜蘆醇可通過下調(diào)內(nèi)耳的caspase-3、Bax表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)發(fā)揮對(duì)糖尿病大鼠內(nèi)耳損傷的保護(hù)作用。
綜述所述,白藜蘆醇可減弱糖尿病大鼠內(nèi)耳血管通透性,對(duì)內(nèi)耳損傷具有一定的保護(hù)作用,機(jī)制可能與其降血糖血脂、抗氧化應(yīng)激、減少VEGF和ICAM-1表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。