李 玥，張恒飛，孟靜靜，常玉雪，周宏艷

(河南工程學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，鄭州 450007)

0 前言

PLA是以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，可以生物降解，實(shí)現(xiàn)在自然界中的循環(huán)，是理想的綠色高分子材料[1-5]。此外，PLA本身還具有良好的生物相容性，目前被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)療領(lǐng)域，如手術(shù)縫合線、防粘連膜、骨填充材料等[6-8]。但是，PLA本身只具備良好的生物相容性，不具備生物活性，因而需要對其進(jìn)行改性以提高其生物活性[9-11]。文獻(xiàn)表明，CeO2具有良好的促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和分化性能，因而將CeO2復(fù)合能夠賦予PLA一定的功能性，從而拓寬其應(yīng)用范圍[12-13]。但是，PLA/CeO2復(fù)合材料無法直接應(yīng)用到醫(yī)療中，需對其進(jìn)行加工。靜電紡絲技術(shù)是目前較為成熟的一種制備超細(xì)纖維膜的一種技術(shù)，其能夠紡制具有可生物降解性、生物相容性并且無毒無害的聚合物的納米級超細(xì)纖維，不僅保留其自身的優(yōu)良性能，而且可制作腫瘤治療載體材料、組織工程支架材料、藥物釋放載體材料，在醫(yī)學(xué)中適用于創(chuàng)傷修復(fù)和移植涂膜等方面[14-18]。本文利用靜電紡絲技術(shù)，制備了PLA/CeO2靜電紡絲復(fù)合纖維，并系統(tǒng)地表征了CeO2對溶液的性質(zhì)、電壓和CeO2用量對纖維直徑、CeO2對細(xì)胞在PLA/CeO2纖維膜上增殖的影響，期望為PLA/CeO2的實(shí)際應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

PLA，粉料，相對分子質(zhì)量為50 000，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；

CeO2，純度>99.99 %，平均顆粒直徑為25 nm，上海晶純生化科技股份有限公司；

二氯甲烷，分析純(含量≥99 %)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

N-N二甲基甲酰胺(DMF)，分析純(含量≥99 %)，上海晶純生化科技股份有限公司；

小鼠成骨前體細(xì)胞，MC3T3-E1，暨南大學(xué)生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室凍存；

堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；

DMEM低糖培養(yǎng)基(含有多種氨基酸以及葡萄糖的培養(yǎng)基)、胎牛血清，美國Gibco公司。

1.2 主要設(shè)備及儀器

旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，NDJ-1，上海平軒科學(xué)儀器有限公司；

全自動(dòng)表面張力儀，QBZY，上海方瑞儀器有限公司；

電導(dǎo)率儀，DDB-303A，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

差示掃描量熱儀(DSC)，Q20，美國TA公司；

X射線衍射儀(XRD)，D8ADVAE，德國布魯克公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)，Quanta 250，捷克FEI公司；

SANS拉力機(jī)，CMT8501，深圳新三思集團(tuán)。

1.3 樣品制備

靜電紡絲液的配制：在制備PLA/CeO2共混體系靜電紡絲溶液時(shí)，以二氯甲烷和DMF的混合溶劑(DMF與二氯甲烷體積比為3∶7)將PLA溶解，同時(shí)借助超聲震蕩儀對PLA進(jìn)行扶助溶解，同時(shí)能夠使CeO2在溶劑PLA溶液中充分分散，盡可能地減少CeO2在PLA溶液中形成團(tuán)聚，從而對紡絲產(chǎn)生影響；同時(shí)根據(jù)本課題組之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PLA靜電紡絲液的最佳濃度為10 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，故在本文中PLA的濃度統(tǒng)一為10 %；此外，CeO2在PLA/CeO2復(fù)合體系中的濃度為0 %、0.5 %、1.0 %、2.0 %、4.0 %和8.0 %；在室溫下，將不同質(zhì)量干燥后的CeO2粉末添加到10 %的PLA溶液中，磁力攪拌12 h，超聲除氣泡后備用；

PLA/CeO2復(fù)合纖維膜的制備：將配置好的不同CeO2含量的PLA/CeO2紡絲溶液在靜電紡絲機(jī)中紡成復(fù)合膜；紡絲電壓為20～28 kV，紡絲機(jī)設(shè)備溫度為35 ℃，靜電紡絲液的注射速率為1.0 mL/h，每個(gè)比例的復(fù)合膜紡絲時(shí)間為6 h。

1.4 性能測試與結(jié)構(gòu)表征

分別采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測試不同CeO2用量的PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲溶液的黏度，測試溫度為25 ℃，旋轉(zhuǎn)速度為12 r/min；采用全自動(dòng)表面張力儀測試不同CeO2用量的PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲溶液的表面張力，測試溫度為25 ℃；采用電導(dǎo)率儀測試不同CeO2用量的PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲溶液的電導(dǎo)率，測試溫度為25 ℃；

PLA/CeO2復(fù)合纖維膜形貌的觀察：將所得到的不同CeO2含量、不同紡絲電壓下的PLA/CeO2復(fù)合纖維膜噴金處理后，通過SEM觀察纖維膜的形貌；

PLA/CeO2復(fù)合纖維膜的DSC分析：將不同CeO2含量的PLA/CeO2復(fù)合纖維膜干燥后，剪取約6～10 mg的放到DSC坩堝內(nèi)，在氮?dú)鈿夥障?，?0 ℃/min的升溫速率升溫至200 ℃，記錄升溫曲線；在200 ℃恒溫5 min，然后以20 ℃/min的速率降溫至25 ℃；

CeO2對PLA/CeO2纖維膜細(xì)胞增殖的影響：MC3T3-E1細(xì)胞株在含10 %小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中培養(yǎng)；將細(xì)胞置于37 ℃、5 %的CO2和95 %濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換一次培養(yǎng)液；同時(shí)將不同CeO2用量的PLA/CeO2靜電紡絲膜剪成直徑約為14 mm的圓形，放入24孔板中，每個(gè)PLA/CeO2比例的材料設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，然后用75 %的醫(yī)用酒精將材料浸泡過夜，然后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，紫外滅菌3 h，然后用含10 %小牛血清的完全培養(yǎng)基浸泡1 h；培養(yǎng)接近融合的MC3T3-E1細(xì)胞，以0.25 %胰蛋白酶消化液制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后稀釋成約1×104個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于放置材料的24孔板中，每孔加1 mL，37 ℃、5 %的CO2條件下孵育1、4、7 d；實(shí)驗(yàn)組為：在有材料的孔內(nèi)1 mL、1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，其中材料分別為：PLA，PLA/0.5 %CeO2，PLA/1.0 %CeO2，PLA2.0 %/CeO2，PLA/4.0 %CeO2的靜電紡絲膜；在細(xì)胞接種后的1、4、7 d分別取出一塊24孔板，吸出培養(yǎng)液，然后每孔加入含有10 % CCK-8的完全培養(yǎng)液350 μL，然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，4 h后將在每個(gè)培養(yǎng)孔中吸取100 μL的液體加入96孔板中，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA/CeO2靜電紡絲液的性質(zhì)

靜電紡絲溶液性質(zhì)對于靜電紡絲是否能夠順利進(jìn)行有著重要影響，尤其是黏度、電導(dǎo)率和表面張力對靜電紡絲的影響尤為重要，因此，本文對不同CeO2用量的PLA/CeO2靜電紡絲液的黏度、電導(dǎo)率和表面張力進(jìn)行了表征，如表1所示。從表1可以看出，不同CeO2用量的PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲液的黏度基本無變化，主要是因?yàn)镃eO2的用量較小，不足以引起復(fù)合靜電紡絲液的變化。PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲液的表面張力隨CeO2用量的增加而逐漸減小，且CeO2用量為8.0 %時(shí)減少較多，由于在紡絲過程中，溶液的表面張力較小時(shí)，在紡絲的過程中比較容易形成液滴，因而CeO2用量為8.0 %時(shí)，不適合進(jìn)行靜電紡絲。此外，PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲液的電導(dǎo)率隨CeO2的用量的增加而逐漸增加，這主要是由于CeO2本身是一種半導(dǎo)體材料，當(dāng)其在溶液中的用量較多的時(shí)候，相應(yīng)的溶液的電導(dǎo)率也逐漸增加。

表1 PLA/CeO2靜電紡絲液的性質(zhì)Tab.1 The properties of PLA/CeO2 electrospinning solution

2.2 PLA/CeO2復(fù)合靜電紡絲纖維

(a)×1 000 (b)×5 000圖1 PLA多孔纖維SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM image of PLA fiber

多孔纖維主要包括纖維之間的空隙和纖維本身的孔，利用靜電紡絲技術(shù)，通過控制靜電紡絲的條件，可以紡制出多孔靜電紡絲膜。如圖1所示，PLA靜電紡絲纖維在絲與絲之間存在著約5 μm大小的空隙，且在PLA纖維的表面也存在著納米級的孔。纖維的比表面積得到了大幅的提升，這說明由PLA/CeO2雜化超細(xì)纖維在諸多領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，如醫(yī)用材料和吸附材料等。

2.3 電壓對PLA/CeO2復(fù)合纖維的影響

在靜電紡絲的實(shí)驗(yàn)過程中，紡絲的主要推動(dòng)力就是電場力，當(dāng)電場力過小時(shí)，將會(huì)對溶液的噴射以及纖維的成型造成影響，當(dāng)電壓過高時(shí)又會(huì)造成溶劑的揮發(fā)問題，因而本文研究了靜電紡絲電壓對于PLA纖維直徑的影響。在不同電壓下進(jìn)行靜電紡絲，得到PLA/CeO2超細(xì)纖維，通過SEM進(jìn)行對纖維進(jìn)行觀察，如圖2所示。從圖2可以看出，隨著靜電紡絲電壓的增加，得到的纖維直徑先減小后增加，通過對不同電壓下得到的纖維進(jìn)行測量(每個(gè)電壓統(tǒng)計(jì)100根纖維，取平均值)，如圖3所示。從圖3可以看出，紡絲電壓在26 kV時(shí)，PLA纖維的直徑最小，約為880 nm。其可能的原因是隨著電壓的增加“泰勒錐”表面電荷較多，電荷形成的場力對液滴的拉伸作用加強(qiáng)，破壞了原有的“電場力 - 表面張力”的之間的平衡，最終導(dǎo)致纖維變細(xì)，在電壓為26 kV時(shí)達(dá)到最小值。但是當(dāng)紡絲電壓為28 kV時(shí)，纖維變粗，這時(shí)在泰勒錐表面積聚的電荷較多，泰勒錐變得不穩(wěn)定，因而形成的纖維變得不穩(wěn)定，因而形成的纖維直徑分布不均勻，同時(shí)由于電壓較高時(shí)，泰勒錐射流過快，導(dǎo)致溶劑不能夠完全揮發(fā)，導(dǎo)致纖維不夠緊密，最后統(tǒng)計(jì)的結(jié)果就是纖維直徑增加，且分布不均勻。因而，通過對比可知，在電壓為26 kV的條件下紡制出的纖維直徑最小，因此確定出最優(yōu)紡絲電壓。

2.4 CeO2添加量對PLA/CeO2復(fù)合纖維的影響

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用最優(yōu)紡絲電壓(26 kV)，研究不同CeO2添加量對PLA/CeO2復(fù)合纖維的影響。從圖4中可以看出，在不同添加量的情況下，紡制出的纖維形貌具有一定差別，純PLA纖維表面較為光滑且纖維粗細(xì)較為均勻，直徑大小基本一致，當(dāng)開始加入CeO2時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)，纖維的表面開始出現(xiàn)孔洞，這也是本文的目的所在，隨著CeO2用量的不斷增加，纖維

電壓/kV：(a)20 (b)22 (c)24 (d)26 (e)28圖2 不同電壓下復(fù)合纖維的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of ultrafine PLA/CeO2 fibers prepared by electrospinning at different voltages

圖3 電壓對PLA纖維直徑的影響Fig.3 The effect of voltages on thediameter of PLA fiber

照片類型，CeO2用量/%：(a)SEM，0 (b)SEM，0.5 (c)SEM，1.0(d)SEM，2.0 (e)SEM，4.0 (f)TEM，2.0圖4 不同CeO2用量對PLA/CeO2復(fù)合纖維直徑的影響的SEM和TEM照片F(xiàn)ig.4 SEM and TEM image of PLA/CeO2 composite fiber with different content of CeO2

圖5 CeO2用量對PLA/CeO2復(fù)合纖維直徑的影響Fig.5 The effect of CeO2 content on the diameter ofPLA/CeO2 composite fiber

表面變得越來越粗糙，孔洞數(shù)目不斷增加。此外，圖4中CeO2用量為2 %時(shí)的TEM圖顯示出纖維表面變得粗糙，且并未看到CeO2團(tuán)聚體，說明CeO2在纖維中的分散較為均勻。從圖5中可以看出，CeO2用量為4 %時(shí)，CeO2分散在PLA機(jī)體中，且有少量的CeO2在PLA表面團(tuán)聚成了小顆粒，但是由于PLA表面僅有少量孔的緣故，故未觀察到CeO2在PLA內(nèi)部的分散情況。此外，對圖4中的纖維進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后(各取100根，取平均值)，得到纖維直徑隨CeO2用量變化的曲線，如圖5所示。從圖5可以看出，隨著CeO2用量的增加，PLA/CeO2復(fù)合纖維的直徑先減小后增加，在CeO2用量為1 %時(shí)達(dá)到最小值，且當(dāng)CeO2用量過多時(shí)，纖維的直徑逐漸增加，且纖維的直徑分布逐漸變寬，造成粗細(xì)不均勻的現(xiàn)象。因而，在CeO2用量為1 %時(shí)是實(shí)驗(yàn)所需的最佳添加量，此時(shí)PLA/CeO2復(fù)合纖維的直徑最小，且較為均勻，同時(shí)纖維上有較多的孔洞，能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.5 熱性能和結(jié)晶性能

1—PLACeO2用量/%：2—0.5 3—1.0 4—2.0 5—4.0圖6 不同CeO2用量時(shí)PLA/CeO2復(fù)合纖維的DSC升溫曲線Fig.6 DSC heating curves of PLA/CeO2 with different content of CeO2

1—PLACeO2用量/%：2—0.5 3—1.0 4—2.0 5—4.0圖7 不同CeO2用量時(shí)PLA/CeO2復(fù)合纖維的DSC降溫曲線Fig.7 DSC cooling curves of PLA/CeO2 with different content of CeO2

圖6和圖7分別為不同CeO2用量的PLA/CeO2復(fù)合纖維的DSC一次升溫和降溫曲線，主要是為了研究CeO2的用量對PLA的熱性能和結(jié)晶性能的影響。從圖6中可以看出，純PLA有多重熔融峰，說明PLA靜電紡絲纖維中含有2種晶型。當(dāng)在PLA靜電紡絲液中添加一定量的CeO2的后，PLA/CeO2復(fù)合纖維中的低溫熔融峰逐漸變小，而高溫熔融峰逐漸變大，且在CeO2用量為1.0 %時(shí)，低溫熔融峰消失，全部轉(zhuǎn)變?yōu)楦邷厝廴诜澹覉D7中降溫曲線中也顯示出，CeO2用量為1 %時(shí)的結(jié)晶溫度較PLA有所升高，說明CeO2能夠促進(jìn)PLA纖維的結(jié)晶性能，能夠促使PLA形成晶格較為緊密的晶體。這主要是由于CeO2在溶劑揮發(fā)的過程中，能夠作為晶核，促進(jìn)PLA分子鏈依附在其表面排列，形成了較為致密的晶格。但是，當(dāng)CeO2用量為4.0 %時(shí)，又出現(xiàn)了小的低溫熔融峰，降溫曲線中CeO2用量為4 %時(shí)的結(jié)晶溫度與CeO2用量為2 %相比也有所降低，這可能是由于CeO2用量較多，在PLA纖維中的分散性變差所導(dǎo)致的。此外，從圖中還可以看出，純PLA纖維出現(xiàn)了較大的冷結(jié)晶峰，說明PLA結(jié)晶不完善，當(dāng)體系中添加了少量的CeO2之后，冷結(jié)晶峰逐漸變?nèi)酰以贑eO2用量為1.0 %和2.0 %時(shí)，冷結(jié)晶峰基本消失，說明CeO2促進(jìn)了PLA的結(jié)晶。與熔融峰一致的是，當(dāng)CeO2用量為4.0 %時(shí)，PLA/CeO2復(fù)合纖維又出現(xiàn)了冷結(jié)晶峰，這說明在CeO2用量為4.0 %時(shí)，復(fù)合纖維的結(jié)晶性能變?nèi)?，也是由于CeO2在PLA纖維中團(tuán)聚所導(dǎo)致的。

2.6 CeO2對PLA/CeO2纖維膜細(xì)胞增殖的影響

CeO2用量/%：■—0.5 ■—1.0 —2.0 —4.0 □—0圖8 CeO2用量對復(fù)合纖維膜細(xì)胞增殖的影響Fig.8 The effect of CeO2 content on the cell proliferation

從圖8中可以看出，在1、4、7 d時(shí)，不同材料組的吸光度值均大于空白組，這說明了添加了CeO2的PLA/CeO2復(fù)合纖維對細(xì)胞是無毒的，具有良好的生物相容性，同時(shí)還可以說明PLA靜電紡絲膜對于細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。同時(shí)還可以看出，PLA/CeO2系列的靜電紡絲膜的吸光度值均大于單純的PLA紡絲膜，且CeO2添加量越高，其吸光度值越大，這說明了CeO2對于具有相當(dāng)明顯的細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，這是因?yàn)镃eO2是一種生物相容性較好，能夠促進(jìn)細(xì)胞生長的材料，將其于PLA進(jìn)行復(fù)合后能發(fā)揮PLA和CeO2的特性。

3 結(jié)論

(1)CeO2的用量對PLA/CeO2靜電紡絲液的黏度基本無影響；但隨著CeO2用量的增加，靜電紡絲液的表面張力逐漸下降，電導(dǎo)率逐漸提高；

(2)隨著紡絲電壓的增加，PLA靜電紡絲纖維的直徑先減小后增加，且電壓較高時(shí)，纖維直徑分布逐漸變寬；

(3)CeO2的添加使PLA/CeO2復(fù)合纖維變細(xì)，較多的CeO2形成團(tuán)聚體后導(dǎo)致纖維變粗，直徑分布變差；

(4)CeO2使PLA/CeO2復(fù)合纖維從多重熔融峰轉(zhuǎn)變?yōu)閱沃厝廴诜?，且有效促進(jìn)了PLA的結(jié)晶；當(dāng)CeO2用量過多時(shí)，結(jié)晶性能下降，重新轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀厝廴诜澹?/p>

(5)PLA/CeO2復(fù)合薄膜具有良好的生物相容性，隨CeO2含量的增加，對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更加明顯。