王文剛，張維濤，王世霞，方 東，王 鵬，程 川

(1.泰山醫(yī)學(xué)院研究生院，山東泰安 271016；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，山東泰安 271000)

前列腺癌是目前全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率比較低，但隨著我國人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)變化以及前列腺特異抗原(prostatic specific antigen，PSA) 篩查的廣泛展開，我國前列腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。雖然早期大多數(shù)前列腺癌患者對內(nèi)分泌治療有效，但在經(jīng)過中位時間18～24個月的緩解期后，幾乎所有患者最終由雄激素依賴性前列腺癌(androgen dependent prostate cancer，ADPC)發(fā)展成為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，最終死于前列腺癌[2]，轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration resistant prostate cancer，mCRPC)患者中位生存時間更是低于2年[3]。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，前列腺癌內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展。雄激素-雄激素受體(androgen receptor，AR)信號通路的一系列改變被認(rèn)為是CRPC發(fā)生耐藥的一個重要機(jī)制，包括AR的再活化(通過AR擴(kuò)增、突變或變異)、通過異常通路激活A(yù)R、以及腫瘤內(nèi)雄激素的產(chǎn)生和可替代的雄激素的產(chǎn)生[4-5]。也有研究表明，非雄性激素通路的激活作用(通過配體依賴性的非甾體分子或不依賴配體而激活雄激素受體的下游信號來激活雄激素受體)，使前列腺癌細(xì)胞的增長和擴(kuò)散已不再受雄性激素的控制，從而產(chǎn)生內(nèi)分泌治療耐藥。因此,盡管雄激素受體機(jī)制依然活躍,但前列腺癌細(xì)胞的增長和擴(kuò)散已不再受雄性激素的控制,這種類型的激活被稱為非雄性激素激活[6-7]。盡管關(guān)于CRPC耐藥機(jī)制已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但目前其具體機(jī)制尚未完全闡明。

在本研究中，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析CRPC的基因表達(dá)譜，并制定了去勢抵抗和激素敏感前列腺癌細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。同時，構(gòu)建了DEGs的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，用以發(fā)掘涉及去勢抵抗性前列腺癌的關(guān)鍵差異基因。研究的目的是進(jìn)一步加強(qiáng)對激素耐藥機(jī)制的理解，并在去勢抵抗性前列腺癌中尋找一些新的潛在治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1樣本來源在美國國立生物信息技術(shù)中心(National Center for Bio-technology Information，NCBI) 的公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)[8]中獲得的登陸號為GSE32269的基因芯片數(shù)據(jù)。研究采用的是由GPL966實(shí)驗(yàn)平臺采集的51個樣本，其中22個樣本為原發(fā)性局限性前列腺癌基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，29個樣本為骨轉(zhuǎn)移去勢抵抗性前列腺癌基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá) 利用R統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。Limma軟件包對前列腺癌及趨勢抵抗性前列腺癌基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘機(jī)生物信息學(xué)分析，獲得其兩者的差異表達(dá)基因，選擇差異最顯著(差異表達(dá)倍數(shù)>1.5，P<0.01)的270個差異表達(dá)基因作為研究對象。

1.2.2GO功能分析及通路富集分析 本研究主要應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫中的GO功能及KEGG通路富集分析模塊對篩選的顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。GO功能分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細(xì)胞成分(cellular component，CC)分析。

1.2.3構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)絡(luò)) 應(yīng)用在線分析工具STRING對DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，并利用Cytoscape軟件對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)繪制。

2 結(jié) 果

2.1DEGs的篩選根據(jù)設(shè)定的參數(shù)(差異表達(dá)倍數(shù)>1.5，P<0.01)，用R軟件對兩組樣本進(jìn)行比較后，共發(fā)掘出270個顯著差異基因，其中上調(diào)差異基因141個，下調(diào)差異基因129個。

2.2上調(diào)及下調(diào)差異基因的KEGG通路富集分析通過DAVID分析，上調(diào)差異基因主要集中在ECM受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、局灶粘連、蛋白質(zhì)消化吸收、阿米巴病等通路中；下調(diào)差異基因主要集中在礦物吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、酪氨酸代謝等通路中。結(jié)果見表1。

表1上調(diào)及下調(diào)差異基因的KEGG通路富集

分類功能計(jì)數(shù)P值UpregulatedDEGs KEGG＿PATHWAYhsa04512：ECM?receptorinteraction147．49×10-14 KEGG＿PATHWAYhsa04151：PI3K?Aktsignalingpathway142．06×10-6 KEGG＿PATHWAYhsa04510：Focaladhesion135．09×10-8 KEGG＿PATHWAYhsa04974：Proteindigestionandabsorption102．29×10-8 KEGG＿PATHWAYhsa05146：Amoebiasis91．58×10-6DownregulatedDEGs KEGG＿PATHWAYhsa04978：Mineralabsorption58．65×10-4 KEGG＿PATHWAYhsa04614：Renin?angiotensinsystem31．94×10-2 KEGG＿PATHWAYhsa00350：Tyrosinemetabolism34．25×10-2

2.3上調(diào)及下調(diào)差異基因的GO功能富集分析利用DAVID對上調(diào)及下調(diào)差異基因所參與的分子功能、生物過程和細(xì)胞成分進(jìn)行分析。其中上調(diào)基因參與的主要分子功能有：蛋白質(zhì)結(jié)合、膠原結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、肝素結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合；生物過程有：細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、膠原分解代謝過程、細(xì)胞分裂；細(xì)胞成分有：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、核質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、膠原蛋白三聚體。下調(diào)基因參與的主要分子功能有：肌動蛋白結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)成分；生物過程有：氧化還原過程、蛋白水解、細(xì)胞粘附、肌肉收縮、藥物反應(yīng)；細(xì)胞成分有：細(xì)胞外基質(zhì)外來體、細(xì)胞質(zhì)、胞外空間、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、局灶粘連。結(jié)果見表2。

表2上調(diào)及下調(diào)差異基因的GO功能富集

分類功能計(jì)數(shù)P值UpregulatedDEGs GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0005515?proteinbinding791．73×10-4 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0005518?collagenbinding116．86×10-12 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0005201?extracellularmatrixstructuralconstituent106．04×10-10 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0008201?heparinbinding101．27×10-6 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0050840?extracellularmatrixbinding67．23×10-7 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0030198?extracellularmatrixorganization206．76×10-17 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0007155?celladhesion202．96×10-10 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0008283?cellproliferation152．07×10-7 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0030574?collagencatabolicprocess125．23×10-13 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0051301?celldivision122．84×10-5 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005737?cytoplasm451．63×10-2 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005576?extracellularregion392．67×10-13 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005654?nucleoplasm297．15×10-3 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0031012?extracellularmatrix262．17×10-21 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005581?collagentrimer113．14×10-10DownregulatedDEGs GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0003779?actinbinding96．33×10-4 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0004252?serine?typeendopeptidaseactivity81．81×10-3 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0005516?calmodulinbinding69．50×10-3 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0008236?serine?typepeptidaseactivity58．93×10-4 GOTERM＿M(jìn)F＿DIRECTGO：0005200?structuralconstituentofcytoskeleton56．78×10-3 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0055114?oxidation?reductionprocess117．45×10-3 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0007155?celladhesion104．30×10-3 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0006508?proteolysis107．42×10-3 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0006936?musclecontraction88．72×10-6 GOTERM＿BP＿DIRECTGO：0042493?responsetodrug84．94×10-3 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0070062?extracellularexosome532．38×10-13 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005829?cytosol331．36×10-2 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005615?extracellularspace275．30×10-7 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0048471?perinuclearregionofcytoplasm155．91×10-5 GOTERM＿CC＿DIRECTGO：0005925?focaladhesion94．36×10-3

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)分析基于STRING的數(shù)據(jù)分析，總共發(fā)現(xiàn)974組蛋白存在作用關(guān)系，而整個網(wǎng)絡(luò)中以TOP2A、CDK1、BIRC5、BUB1、AURKA、FOXM1、DCN、EZH2、TYMS、ASPM蛋白與其他大于30個蛋白存在相互作用關(guān)系(degree>30)，說明這些蛋白在前列腺癌內(nèi)分泌治療耐藥過程中具有重要的生物學(xué)意義(圖1)。

圖1差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

目前，對于CRPC內(nèi)分泌治療耐藥的確切發(fā)生和發(fā)展機(jī)制仍不十分清楚，因此，CRPC的治療不僅是目前臨床治療的難點(diǎn)，也是基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)。隨著第二代基因測序技術(shù)的發(fā)展，為生物信息學(xué)的研究提供了豐富的資源，極大地推動了生物信息學(xué)的發(fā)展[9]。本研究結(jié)合基因芯片和生物信息學(xué)技術(shù)，共挖掘出270個顯著差異基因。用STRING在線工具對CRPC相關(guān)差異基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白間的相互作用節(jié)點(diǎn)主要集中在TOP2A、CDK1、BIRC5、BUB1、AURKA、FOXM1、DCN、EZH2、TYMS、ASPM等基因。通過文獻(xiàn)挖掘?qū)@些基因進(jìn)一步的研究，我們發(fā)現(xiàn)這其中有些基因與CRPC的關(guān)系已有文獻(xiàn)報(bào)道，部分基因與CRPC的關(guān)系報(bào)道甚少。

TOP2A是一種編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的基因，該基因中的幾種突變體與腫瘤的耐藥性有關(guān)，并已作為幾種抗癌劑的作用靶點(diǎn)。MURPHY等[10]的研究表明，TOP2A的擴(kuò)增與高級別前列腺癌的雄激素抵抗及存活率降低有關(guān)。LI等[11]通過抑制DU145細(xì)胞的TOP2A表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖和致瘤性顯著降低。最近，LABBé 等[12]研究發(fā)現(xiàn)TOP2A和EZH2可作為轉(zhuǎn)移潛能增加患者的分子標(biāo)志物，其早期發(fā)現(xiàn)可使患者從輔助靶向治療中獲益。EZH2基因參與形成多聚體蛋白復(fù)合物，其涉及維持細(xì)胞世代連續(xù)基因的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)。ARMSTRONG等[13]的最新研究數(shù)據(jù)表明，CCN3-EZH2-AR反饋環(huán)路可作為CRPC的潛在治療靶點(diǎn)。同時，WU等[14]通過放化療及小分子抑制劑對EZH2抑制，誘導(dǎo)了CRPC細(xì)胞的死亡。由此可見，TOP2A和EZH2可作為CRPC治療靶基因，具有很高的研究價(jià)值。

CDK1是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與G1/S-期和G2/M期轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白B形成復(fù)合物[15]。在CRPC激素剝奪治療中CDK1活性增加可使AR表達(dá)升高[16]。SARWAR等[17]研究表明，AR-V7與CDK1和磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶α相互作用以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移生長和治療抵抗。因此，CDK1抑制劑有希望成為新型CRPC治療劑。而BUB1在CRPC中尚未得到很好的研究。BUB1是主軸組裝檢查點(diǎn)(SAC)的中心組成部分，在有絲分裂中起著重要作用，該基因的突變與非整倍體和多種癌癥有關(guān)[18]。WANG等[19]通過體外實(shí)驗(yàn)表明，通過降低BUB1的表達(dá)，可以降低乳腺癌細(xì)胞的生長，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲；檢測BUB1的表達(dá)可能有助于乳腺癌預(yù)后的預(yù)測。本研究中BUB1表達(dá)上調(diào)，其與CRPC關(guān)系有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

FOXM1和AURKA參與細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。最近PENG等[20]實(shí)驗(yàn)研究已證明FOXM1和AURKA通過長鏈非編碼RNA HOXD-AS1的激活來促進(jìn)前列腺癌的增殖、去勢抗性和化療抗性，這為CRPC提供了潛在治療方法。以往對人肺、肝臟、結(jié)直腸和宮頸腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，DCN可與EGFR直接相互作用以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長[21-22]。HU等[23]的最新實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)DCN可抑制EGFR和AR表達(dá)和磷酸化，并抑制雄激素非依賴性前列腺癌的生長。以DCN為靶點(diǎn)治療CRPC將有廣闊的臨床研究前景。

本研究中TYMS、BIRC5、ASPM基因差異表達(dá)同樣明顯，但文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)其與CRPC的關(guān)系報(bào)道甚少。TYMS編碼胸苷酸合酶，是DNA復(fù)制和修復(fù)所必需的酶[24]。RAHMAN等[25]通過體外研究表明，TYMS的過度表達(dá)足以將哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性表型。對于前列腺癌，幾個涉及52～172例患者的研究表明TYMS表達(dá)水平可能與不良的腫瘤表型相關(guān)[24]。BIRC5是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白，引起了許多研究者的關(guān)注，在許多類型的癌細(xì)胞(包括胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等)中過度表達(dá)[26]。由于BIRC5在多種癌癥中的高表達(dá)與生存期減少有關(guān)，將成為近年來癌癥治療的可能靶點(diǎn)之一。ASPM編碼的蛋白質(zhì)在有絲分裂紡錘體調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生和小頭畸形中起關(guān)鍵作用[27-28]。XIE等[29]通過基因芯片分析數(shù)據(jù)表明，ASPM可能在前列腺癌的進(jìn)展中起重要作用，ASPM的表達(dá)增加可能潛在地預(yù)測前列腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率降低。因此，通過文獻(xiàn)挖掘我們發(fā)現(xiàn)，這些基因與多種癌癥及癌細(xì)胞惡化程度增加有關(guān)。通過對這些基因進(jìn)行進(jìn)一步的研究，可能會發(fā)現(xiàn)CRPC新的治療靶點(diǎn)。

在我們的生物信息學(xué)分析中，差異基因的GO功能分析及通路富集分析主要參與細(xì)胞分裂、蛋白質(zhì)及膠原結(jié)合、膠原結(jié)合、氧化還原過程、藥物反應(yīng)、局灶粘連、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成及結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、ECM受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收、絲氨酸型肽酶活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合等分子生物功能及信號通路。PI3K-Akt信號通路是一種重要的致癌信號通路，與腫瘤的發(fā)生及對多種腫瘤類型的常規(guī)和靶向抗癌治療的耐藥性有關(guān)[30]。在前列腺癌中，PI3K-Akt信號通路的激活與前列腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)[31]。CARVER等[32]證實(shí)PI3K信號通路抑制了AR的轉(zhuǎn)錄活性。PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑與其他治療方法聯(lián)合應(yīng)用治療CRPC已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中[33]。我們相信，在對這些分子生物功能及信號通路的進(jìn)一步研究中，對CRPC的治療將會有更多新的發(fā)現(xiàn)。

利用生物信息學(xué)方法對CRPC與ADPC的DEGs進(jìn)行系統(tǒng)的分析，可有效發(fā)掘這些差異基因的相互作用信息，為去勢抵抗性前列腺癌的早期診斷及治療靶點(diǎn)選擇提供了新的線索和方向。