納米銀和PVP包被納米銀對HepG2細(xì)胞遺傳毒性的比較研究

王秀娟，李婷竹，陸強，蘇雪榮，薛玉英,*，唐萌

1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，南京 210009 2. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 & 蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210009 3. 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，南京 210009

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米產(chǎn)品層出不窮。在眾多的納米材料中，納米銀因其優(yōu)良的抗菌殺菌性能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工、化妝品、陶瓷、紡織、半導(dǎo)體材料，水質(zhì)凈化等領(lǐng)域[1]。廣泛的應(yīng)用使人體暴露納米銀的機會大大增加，有研究表明，納米銀可能與體內(nèi)不同組織、細(xì)胞或生物分子產(chǎn)生相互作用[2-5]，帶來潛在的安全隱患，評估其生物安全性至關(guān)重要。

遺傳毒性在安全性評價中不可或缺，有研究者用粒徑為55 nm的納米銀對SD大鼠在其懷孕的第7～20天，每天分別以 0、0.2、2、20 mg·kg-1的劑量進(jìn)行灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)納米銀可穿越胎盤屏障，到達(dá)胎鼠體內(nèi)，并引起孕鼠及子鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變[6]。Wen等[7]用納米銀(6.3～629 nm)對大鼠以5 mg·kg-1的劑量進(jìn)行靜脈染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比實驗組大鼠染色體斷裂和多倍體細(xì)胞率顯著增加，表明納米銀具有潛在的遺傳毒性。Tavares等[8]用納米銀(5～45 nm)染毒人外周血細(xì)胞，彗星實驗結(jié)果表明在各染毒劑量下(10、25、50 μg·mL-1)納米銀均會對細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性作用，但隨著時間的推移納米銀對DNA的損傷逐漸減少，說明在低劑量染毒細(xì)胞時，隨著時間的增加，納米銀對細(xì)胞造成的遺傳毒性會因為細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)而降低。目前，關(guān)于納米銀的體外遺傳毒性研究還不是很充分，有待進(jìn)一步探索。

本研究選擇人肝癌(HepG2)細(xì)胞株為研究對象，以無包被納米銀和PVP包被納米銀為材料，通過彗星實驗和胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗研究納米銀對DNA、染色體的影響，從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發(fā)，通過分析、比較2種納米銀的遺傳作用特征，較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系，為納米材料體外遺傳毒性評估提供實驗依據(jù)。此外，本研究確定了由彗星實驗與胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗結(jié)合的方法，利用HepG2細(xì)胞作為體外評價模型，能方便快速檢測納米銀材料的遺傳毒性效應(yīng)，進(jìn)而可以利用該組合實驗篩檢市場中納米材料的遺傳毒性效應(yīng)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與細(xì)胞

20 nm PVP包被納米銀粉體(上海滬正納米科技有限公司)，20 nm 無包被納米銀粉體(上海允復(fù)納米科技有限公司)，重鉻酸鉀(K2Cr2O7，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，陽性對照絲裂霉素C(Mitomycin C, MMC, Sigma-Aldrich公司)，HepG2細(xì)胞株(Human hepatoma cell line，人肝癌細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)。

1.2 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)液(美國GE公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，博士德生物工程有限公司)，細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Oxiselect彗星實驗試劑盒(Oxiselect comet assay kit，美國Cell Biolabs公司)，TE緩沖液(北京天恩澤生物技術(shù)有限公司)，氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，75%酒精(永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司)，細(xì)胞松弛素-B(Cytochalasin B，Cyt-B，CAS：14930-96-2，美國Sigma -Aldrich 公司)，吉姆薩粉末(Giemsa，中國Biosharp公司)。

1.3 主要儀器

3423型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，TDZ6B-WS水平離心機(上海盧湘儀器廠)，5424R型離心機(德國Eppendorf公司)，KQ-2200E型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)，F(xiàn)SX100型智能生物圖像導(dǎo)航儀(日本OLYMPUS公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素)于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4.2 Hoechst-33258染色測細(xì)胞凋亡

將潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105個·mL，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜，使其密度至50%～80%滿。后分別用20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1的納米銀染毒細(xì)胞。24 h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液，固定10 min，去固定液。用PBS洗2遍，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，置搖床上染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。在生物導(dǎo)航儀上觀察細(xì)胞。

1.4.3 彗星實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于12孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·mL，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后吸去原培養(yǎng)液，空白對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組加入294 μg·mL-1的重鉻酸鉀溶液，實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。按照彗星實驗試劑盒操作說明檢測DNA損傷。實驗重復(fù)3次，每次實驗每個劑量隨機選擇50個細(xì)胞用Comet Assay軟件(CASP，http://casplab.com/)分析。3次實驗的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比的平均值用以表達(dá)DNA損傷。

1.4.4 胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于12孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個·mL，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h后吸去原培養(yǎng)液，實驗組分別加入20、40、80、160 μg·mL-1的納米銀溶液，陽性對照組加入0.1 μg·mL-1的絲裂霉素C，胞質(zhì)阻滯松弛素B在染毒時同時加入，濃度為4 μg·mL-1，染毒24 h后，吸去染毒液將細(xì)胞固定滴片，后用Giemsa 染液進(jìn)行染色，最后用生物導(dǎo)航儀讀片，對2種納米銀每個染毒劑量均觀察3次不同區(qū)域的細(xì)胞，每次觀察1 000個雙核細(xì)胞，統(tǒng)計1 000個細(xì)胞中總微核(Ⅰ型微核+Ⅱ型微核)、Ⅰ型微核、Ⅱ型微核、核芽、核質(zhì)橋的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 納米銀表征結(jié)果

透射電鏡(TEM)檢測結(jié)果如圖1所示，通過TEM觀察到分散于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中的2種納米銀顆粒均為球形，無包被的納米銀有團(tuán)聚現(xiàn)象，PVP包被的納米銀分散均勻，無團(tuán)聚現(xiàn)象。通過Nano Measurer 1.2.5 軟件測量20 nm無包被納米銀平均粒徑為(18.29±5.50) nm，20 nm PVP包被的納米銀平均粒徑為(19.95±4.75) nm。

2.2 納米銀對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

生物導(dǎo)航儀讀片可見陽性對照組凋亡細(xì)胞比較多，各處理組有少量的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，其他都為正常的細(xì)胞核形態(tài)，正常細(xì)胞核內(nèi)DNA分布相對均勻，細(xì)胞核無固縮，在視野中呈現(xiàn)體積較大的且染色顏色較淺的核形態(tài)，納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響見圖2，各實驗處理組HepG2 細(xì)胞凋亡率結(jié)果見表1。

圖1 納米銀顆粒TEM圖注：A, 20 nm AgNPs的TEM圖； B, 20 nm-PVP AgNPs的TEM圖。Fig. 1 The TEM diagram of nano silver particlesNote: A, the TEM diagram of 20 nm AgNPs; B, the TEM diagram of 20 nm-PVP AgNPs.

圖2 不同特性納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響注：Hoechst 33258染色，×100，箭頭所指為凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核。A，空白對照組；B，陽性對照組；C1～C4，20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80, 160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80 160 μg·mL-1。Fig. 2 The influence of different characteristics of nano silver on the nuclear form of HepG2Note: Hoechst 33258 staining, ×100; the arrow refers to the nucleus of apoptotic cells. A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1).

表1可知，與正常對照組比較，20 nm AgNPs組在劑量為160 μg·mL-1時凋亡細(xì)胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs的80 μg·mL-1、160 μg·mL-1組凋亡細(xì)胞核相比于空白對照組明顯增多(P<0.05，P<0.01)。2種納米銀使HepG2細(xì)胞呈濃度依賴性的細(xì)胞凋亡(20 nm AgNPs：P<0.05，r=0.997；20 nm PVP-AgNPs：P<0.05，r=0.999)。析因設(shè)計方差分析比較可知，20 nm PVP-AgNPs對HepG2細(xì)胞凋亡的影響大于20 nm AgNPs(P<0.05)。

圖3 彗星圖像(×42)注：A，空白對照組；B，陽性對照組；C1～C4，20 nm AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1)；D1～D4，20 nm PVP-AgNPs組(劑量分別為20, 40, 80,160 μg·mL-1)。Fig. 3 The comet image (×42)Note: A, blank control group; B, positive control group; C1-C4, 20 nm AgNPs group (20, 40, 80, 160 μg·mL-1); D1- D4, 20 nm PVP-AgNPs group (20, 40, 80,160 μg·mL-1).

表1 不同特性納米銀對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 The effect of silver nanoparticles with different properties on the apoptosis rate of HepG2 cells

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note: Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

2.3 納米銀對DNA損傷的影響

實驗所得彗星圖像見圖3，空白對照組彗星頭部DNA致密，無尾部；陽性對照組頭部DNA集中，亮度很強，尾部由DNA斷片組成呈掃帚狀，熒光強度不及頭部。2種納米銀處理組中小于等于40 μg·mL-1劑量組均能觀察到頭部DNA致密，無明顯尾部或尾部很短；大于等于80 μg·mL-1的各個劑量組的彗星頭部DNA集中，亮度較強，尾部成呈掃帚狀，熒光強度不及頭部。利用彗星分析軟件(Comet Assay Software Project, CASP)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2種不同包被納米銀的不同濃度的Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比結(jié)果見表2。

由單因素方差分析結(jié)果可知，在染毒24 h后，陽性對照組Olive尾矩、尾長和尾部DNA百分比與空白對照組對比有顯著差異(P<0.01)。20 nm AgNPs組中除了20 μg·mL-1的Olive尾矩與尾長，其余均與空白對照組有顯著差異(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs組除了20 μg·mL-1的DNA百分比，其余均與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。析因設(shè)計方差分析比較可知，2種納米銀使HepG2細(xì)胞DNA斷裂程度：20 nm AgNPs > 20 nm PVP-AgNPs(P<0.05)。

2.4 納米銀對細(xì)胞核的影響

如圖4，胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗中，納米銀引起細(xì)胞核出現(xiàn)Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核、核芽、核質(zhì)橋等特征性改變，不同特性納米銀染毒HepG2細(xì)胞微核組學(xué)效應(yīng)見表3。

如表3所示，與陰性對照組相比，20 nm AgNPs 在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后微核總數(shù)顯著升高 (P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后微核總數(shù)均顯著升高 (P<0.01)。20 nm AgNPs在80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅰ型微核數(shù)顯著升高(P<0.01)；20 nm PVP-AgNPs在20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅰ型微核數(shù)均顯著升高(P<0.01)。與陰性對照組相比，2種納米銀材料在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后Ⅱ型微核數(shù)均顯著升高(20 nm AgNPs，P<0.05；20 nm PVP-AgNPs，P<0.01)。20 nm AgNPs在160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后核芽數(shù)顯著升高(P<0.05)；20 nm PVP-AgNPs在40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1濃度下染毒HepG2細(xì)胞后核芽數(shù)均顯著升高(P<0.01)；與陰性對照組相比，2種納米銀各濃度劑量下核質(zhì)橋數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。各效應(yīng)指標(biāo)的組間比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除核質(zhì)橋外，2種納米銀材料引起的總微核數(shù)、Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核數(shù)、核芽數(shù)均有差異(P<0.05)，20 nm PVP-AgNPs對細(xì)胞核的影響大于20nm AgNPs。直線相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 nm AgNPs組中，除核質(zhì)橋外，各效應(yīng)指標(biāo)均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05，r>0.7)，20 nm PVP-AgNPs組中，除核質(zhì)橋和核芽外，其他效應(yīng)指標(biāo)均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(P<0.05，r>0.7)，表明納米銀對HepG2細(xì)胞的遺傳毒性損傷存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 2種納米銀染毒HepG2細(xì)胞Olive尾矩、尾長、尾部DNA比值結(jié)果Table 2 The results of Olive tail moment, tail length and tail DNA ratio of HepG2 cells exposed to two kinds of nano silver

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the control group,aP<0.05，bP<0.01.

3 討論(Discussion)

在納米銀的生產(chǎn)和應(yīng)用過程中，常用不同材料對納米銀進(jìn)行表面修飾以改善其分散性和穩(wěn)定性，如PVP、檸檬酸鈉和多聚糖等，不同包被的納米銀可能影響與細(xì)胞的相互作用[9]。Ahamed等[10]用25 nm多聚糖包被的納米銀和未包被的納米銀以50 μg·mL-1對鼠胚胎干細(xì)胞與鼠胚胎纖維母細(xì)胞進(jìn)行染毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多聚糖包被納米銀比未包被納米銀表現(xiàn)出更強的細(xì)胞毒性和遺傳毒性。Nguyen等[11]的研究則表明，用未包被的納米銀(20 nm、40 nm、60 nm、80 nm)染毒鼠巨噬細(xì)胞和人結(jié)腸上皮細(xì)胞比用PVP包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)和檸檬酸鹽包被納米銀(10 nm、50 nm、75 nm)對細(xì)胞活性的抑制作用更大。本研究結(jié)果表明，PVP包被的納米銀與無包被的納米銀引起細(xì)胞DNA損傷與染色體畸變的程度不同，這可能與2種材料的銀離子釋放量不同有關(guān)，因為納米銀的毒性作用可由粒子表面釋放的銀離子引起[12]，而納米銀的表面涂層材料影響Ag+釋放[13]。

圖4 胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗細(xì)胞分類注：A，雙核正常細(xì)胞；B，含有Ⅰ型微核的雙核細(xì)胞；C，含有Ⅱ型微核的雙核細(xì)胞；D，含有核芽的雙核細(xì)胞；E，含有核質(zhì)橋的雙核細(xì)胞。Fig. 4 The cell classification of cytokinesis micronuclear test cellsNote: A, double nucleus normal cell; B, cells containingⅠmicrokernel dual-core; C, cells containingⅡmicrokernel dual-core; D, binuclear cells containing nuclear sprouts; E, a dual-core cell containing a nuclear bridge.

表3 不同特性納米銀染毒HepG2細(xì)胞微核組學(xué)效應(yīng)Table 3 Micronucleus effect of HepG2 cells exposed to nano silver with different properties

注：與空白對照組比較，aP<0.05，bP<0.01。Note：Compared with the blank control group,aP<0.05，bP<0.01.

本研究采用凋亡實驗、彗星實驗和胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗結(jié)合，從多遺傳終點和遺傳毒作用機制角度出發(fā)，通過分析、比較2種不同納米銀的遺傳作用特征，從體外角度較全面地分析納米銀遺傳毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在進(jìn)行彗星實驗之前，對細(xì)胞樣本進(jìn)行“活力檢查”是很常見的，最常見的試驗是臺盼藍(lán)排斥試驗。而彗星實驗針對細(xì)胞核，而非細(xì)胞，細(xì)胞被檢測方法判定死亡不一定核就不完整(例如離心造成的細(xì)胞膜破裂，而臺盼藍(lán)染料能進(jìn)入膜破裂的細(xì)胞，使細(xì)胞染色)，在這種情況下細(xì)胞活力不是一個有意義的概念，且Hoechst 33258對細(xì)胞核染色清晰，不僅能測定凋亡率，而且可以清楚地觀察到核形態(tài)，所以，在評價遺傳毒性前，先用Hoechst 33258熒光染色法評價納米銀對HepG2細(xì)胞核形態(tài)與凋亡率的影響。

彗星實驗結(jié)果表明，2種納米銀均會引起DNA損傷，這與很多研究結(jié)果類似[14-15]，如用PVP包被納米銀處理宮頸癌(Hela)、乳腺癌(MDA-MB-231和MCF-7)細(xì)胞12或24 h，彗星實驗結(jié)果均顯示出嚴(yán)重的DNA損傷[16]。同樣，在本研究的胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗中，除核質(zhì)橋及核芽外，2種納米銀引起的染色體畸變各效應(yīng)指標(biāo)均呈隨染毒濃度增高而增高的趨勢，表明納米銀對HepG2細(xì)胞染色體丟失、染色體斷裂、基因擴(kuò)增與基因量改變等遺傳毒性效應(yīng)呈濃度相關(guān)性。Sahu等[17]在肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和Caco細(xì)胞中，在0.5至15 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)納米銀誘導(dǎo)具有微核的雙核細(xì)胞頻率以濃度和時間依賴性的方式增加。Papageorgiou等[18]的研究表明，隨著納米銀濃度的增加，MCF-7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)隨之下降，濃度越大有絲分裂指數(shù)越小，并觀察到不同類型的染色體畸變。

綜上所述，納米銀對HepG2細(xì)胞可產(chǎn)生DNA損傷、染色體畸變等遺傳毒性效應(yīng)，無包被納米銀比PVP包被納米銀更容易引起DNA損傷，PVP包被納米銀比無包被納米銀更容易引起細(xì)胞染色體畸變相關(guān)效應(yīng)，且損傷程度與濃度相關(guān)，濃度越高遺傳損傷越嚴(yán)重。本研究通過彗星實驗與胞質(zhì)分裂阻滯微核細(xì)胞組學(xué)試驗相結(jié)合探討不同包被納米銀的體外遺傳毒性差異，為納米銀的體外遺傳毒性評估提供參考依據(jù)。