利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚bco1基因與bco1l基因

李文龍，馮永永，李凱彬,*，聶湘平,#

1. 暨南大學生命科學技術(shù)學院生態(tài)系/水生生物研究中心，廣州 510632 2. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380

維生素A是一種必需生物活性物質(zhì)，但是動物本身并不能直接合成維生素A。有證據(jù)表明，過量的維生素A對動物體具有一定的毒性[1]。因此，動物大都不能直接喂食維生素A而需要攝食植物來源的維生素A前驅(qū)物質(zhì)，然后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成維生素A。其中β-胡蘿卜素是較為重要的來源[2]。β-胡蘿卜素-15,15′-加氧酶(β-carotene-15,15′-momoxygenase 1，bco1)是將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A的關鍵酶，因此該酶對動物體內(nèi)胡蘿卜素消化吸收、代謝轉(zhuǎn)運及動物生長發(fā)育等都有重要影響。它能夠通過對稱性裂解將β-胡蘿卜素在15′,15′鍵位置斷開，生成2分子的全反式視黃醛，最后生成視黃酸或維生素A[3]。在通過用定點誘變替換小鼠bco1酶中保守的組氨酸和酸性殘基以及整個家族中非保守的4個組氨酸和一個谷氨酸來產(chǎn)生突變形式的bco1的研究中發(fā)現(xiàn)，bco1的活性中心由4個完全保守的組氨酸和5個酸性殘基(His172，His237，His308，His514，Asp52，Glu140，Glu314，Glu405和Glu457)組成，此酶必須通過亞鐵離子與4個殘基、水、氧分子連接，組成一個特殊的八面體結(jié)構(gòu)才具有活性，4種保守組氨酸和Glu405中的任何一種產(chǎn)生突變都會導致小鼠bco1活性完全喪失[3-4]。Hessel等[5]在敲除小鼠bco1基因的試驗中發(fā)現(xiàn)，bco1功能的缺失能夠?qū)е戮S生素A缺乏，當進一步喂食富含β-胡蘿卜素的飼料后，在小鼠的肝臟、肺臟和脂肪組織均有大量的β-胡蘿卜素積累。因此bco1是β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成維生素A過程中關鍵酶[6]。

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) 系統(tǒng)，是利用繼鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)之后第三代人工核酸內(nèi)切酶的基因編輯系統(tǒng)，可用于多種基因組的編輯[7]。該系統(tǒng)最初是細菌應對噬菌體、病毒、質(zhì)粒或其他染色體編碼序列等的免疫系統(tǒng)[8]。其原理是通過特定的小分子RNA識別靶向序列，以此導向核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到相應的位點上，并造成平末端雙鏈缺口。裂解位點通常由錯誤傾向的非同源末端連接(NHEJ)機制不完全修復，通過引入插入或缺失導致基因突變。與第一代基因編輯技術(shù)的鋅指核酸酶(ZFN)和第二代基因編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應核酸酶(TALEN)等其他靶向突變工具相比，CRISPR/Cas9的實驗設計非常簡單快速[7]。目前已有在人類細胞、斑馬魚[9-12]和小鼠等多種基因組靶向修飾上成功應用該技術(shù)的例子。該技術(shù)可以對基因進行移碼突變、定點敲入、兩位點同時突變和小片段的缺失等基因修飾。由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點，被認為是一種具有廣闊應用前景的基因組定點改造分子工具[13]。

斑馬魚(Daniorerio)因其個體小，便于飼養(yǎng)，已作為生物、醫(yī)學、生態(tài)毒理等多個領域的模式動物被廣泛研究，在環(huán)境毒理及醫(yī)學等方面研究都有成熟的標準方法[14-17]。斑馬魚繁殖快，單次產(chǎn)卵數(shù)量多，而且卵期的胚胎全透明，可以十分便捷地觀察整個胚胎發(fā)育過程。以斑馬魚受精卵作為胚胎急性毒性暴露實驗已成為一種公認的檢測物質(zhì)毒性的有效方法，不僅與成魚毒性試驗有較好的對應關系，而且更為敏感，并且能夠完善成魚實驗無法實現(xiàn)的有關發(fā)育影響的研究[18-19]。因此，本實驗利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚的與bco1編碼相關的bco1和bco1l基因，并且通過多代遺傳獲得具有可遺傳突變類型的個體，為深入開展對斑馬魚bco1的功能研究、以及后續(xù)對bco1和bco1l基因兩者功能與關系的研究奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

斑馬魚Tuebingen(Tu)品系野生型由珠江水產(chǎn)研究所提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質(zhì)粒pXT7-Cas9和pMD-gRNA由北京大學的熊敬維與張博教授提供[20-21]。超微量基因型鑒定YSY Buffer(南京堯順禹生物科技有限公司)；Golden Easy PCR System (TIANGEN)；凝膠電泳回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500-02(Omega)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Axgen)；gRNA用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXIscript?T7 Kit(Ambion)；Cas9 mRNA及yfp-nanos3 mRNA用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion)，加尾試劑盒Poly (A) Tailing Kit(Ambion, AM1350)；RNA純化試劑盒RNease Mini kit T4104(Qiagen)；基因型檢測用載體pMDTM18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)；PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)。

1.2 實驗方法

1.2.1 查找序列

在基因組序列數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁http://asia.ensembl.org/中搜索斑馬魚bco1與bco1l相關基因信息，包括核苷酸序列、基因組結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的保守功能結(jié)構(gòu)域等。根據(jù)所得該基因信息選定其中涉及所有轉(zhuǎn)錄本的外顯子一段序列，特別是要優(yōu)先選擇編碼蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域的外顯子及靠近上游的外顯子。根據(jù)所選片段設計檢測引物并進行驗證，確定可以擴增出所需片段，確定能夠設計多個sgRNA識別位點以保證檢測到有效的sgRNA。

1.2.2 CRISPR的設計與合成

在CRSIPR設計網(wǎng)頁http://crispr.mit.edu/中輸入選定的序列，可得到所有可用的CRISPR序列以及相應的評分。選取合適位點的CRISPR序列作為檢測對象，在選取的CRISPR序列前方添加T7啟動子序列TAATACGACTCACTATA及識別堿基G(如所設計CRISPR序列起始堿基即為G，可不加)，后方添加部分骨架序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGC(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成設計的DNA片段)，然后以合成DNA片段作為正向引物及骨架通用反向引物PRgRNA: 5′AAAAAAAGCACCGACTCGGT 3′，以pMD-gRNA質(zhì)粒作為模板，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)通過PCR擴增出轉(zhuǎn)錄所需DNA片段，PCR反應條件為35×(98 ℃、10 s; 55 ℃、5 s; 72 ℃、5 s); 4℃保存，各成分用量按照說明書確定。用2%瓊脂糖凝膠進行電泳確定目標片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)過無RNA酶污染的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后，用2%瓊脂糖凝膠進行電泳確定目標片段；再以純化產(chǎn)物為模板，用MAXIscript?T7 Kit轉(zhuǎn)錄成RNA，加入無RNA酶污染的醋酸鈉至體系(pH=5.2)，再加入無RNA酶污染的無水乙醇至體積分數(shù)為70%，置于-20 ℃過夜。過夜沉淀后體系在4 ℃、12 000 g條件下離心20 min，棄上清；以70%無RNA酶污染的無水乙醇清洗沉淀，再在4 ℃、12 000 g條件下離心20 min，棄上清，加10L DEPC-H2O溶解沉淀，取2L以2%瓊脂糖凝膠進行電泳，以確定目標片段，并用微量分光光度計(OD 1000, One drop)測定濃度，備用。

1.2.3 Cas9 mRNA與yfp-nanos3 mRNA的合成

Cas9 mRNA與yfp-nanos3 mRNA則在各自的質(zhì)粒以EcoRI、HindIII酶，在37 ℃下酶切過夜后，用2%瓊脂糖凝膠進行電泳確定目標片段，經(jīng)過無RNA酶污染的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收，再由無RNA酶污染的T7 mMESSAGE mMACHINE Kit轉(zhuǎn)錄，并用無RNA酶污染的Poly (A) Tailing Kit進行帶帽加尾，用無RNA酶污染的RNA純化試劑盒RNease Mini Kit T4104純化后，用2%瓊脂糖凝膠進行電泳確定目標片段并用微量分光光度計(OD 1000, One drop)測定濃度，備用。

1.2.4 顯微注射

于注射前一天把野生親本以雌：雄為1:2的比例放置到產(chǎn)卵缸內(nèi)，并且以隔板隔開，黑暗養(yǎng)殖8 h以上。注射當天早上拉開隔板，待野生親本產(chǎn)卵后，于Ⅰ-細胞期內(nèi)，將Cas9 mRNA調(diào)整到300 ng·L-1，與yfp-nanos3 mRNA、sgRNA各0.5L混勻進行顯微注射。

1.2.5 sgRNA活性檢測

在顯微注射后的12 h至24 h之間，在熒光顯微鏡下挑選5個能觀察到黃色熒光的魚卵，制備基因組DNA模板，以各自目標片段檢測引物進行PCR擴增，PCR反應條件為94 ℃，5 min；35×(94 ℃、30 s; 58 ℃、30 s; 72℃、30 s)；72 ℃，10 min；4 ℃保存，各成分用量按照說明書要求確定。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠進行凝膠電泳后用凝膠電泳回收試劑盒純化，純化產(chǎn)物與pMDTM18-T載體進行連接，各成分用量按照說明書要求，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，將熱激活后的大腸桿菌涂至含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18 h后挑取12個單菌落分別培養(yǎng)后進行測序，檢驗是否出現(xiàn)突變、突變效率及突變位點以確定獲得有活性的sgRNA。

1.2.6 可遺傳突變個體的篩選與培育

同批量注射的斑馬魚受精卵選定作為首建者在實驗室養(yǎng)殖，性成熟后配對繁殖，受精卵發(fā)育至1 000細胞以上時制備基因組DNA模板，通過PCR檢測、凝膠電泳及測序，了解不同F(xiàn)0親魚所能產(chǎn)出F1代目標基因的突變情況，檢測bco1基因引物為正向引物bco1-S1: 5′AGGCAAGTTAGGGTAATGAT3′，反向引物bco1-A1：5′TCAACTGCACCACAGAGTAA3′；檢測bco1l基因引物為正向引物bco1l-S1: 5′CTTGCCTCCCAGAATTGAC3′，反向引物bco1l-A1：5′CTGAGAACAGACCAGGACCATT3′。選取F1代經(jīng)PCR檢測后，進行凝膠電泳時出現(xiàn)明顯雙條帶樣品，提示出現(xiàn)了較大片段的缺失或插入突變，便于后續(xù)對突變位點的檢測；通過測序比對，篩選缺失或插入堿基數(shù)非3倍數(shù)突變，在此基礎上選擇產(chǎn)出長片段有效突變的首建者魚，產(chǎn)卵獲得F1代群體。F1代培養(yǎng)至性成熟，通過檢測尾鰭的DNA篩選所需基因型的F1代魚，相同基因型的F1代魚自交得F2代，待F2代培養(yǎng)至50日齡，通過檢測尾鰭的DNA篩選出突變純合子。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 所得基因相關信息

由網(wǎng)頁http://asia.ensembl.org/查得bco1與bco1l基因序列信息，bco1基因信息見網(wǎng)頁(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Gene/Summary?db=core;g=ENSDARG00000104256;r=7:65037326-65066446)；bco1l基因信息見網(wǎng)頁(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Transcript/Summary?db=core;g=ENSDARG00000103659;r=7:65016199-65028910;t=ENSDART00000168287)(圖1)。

根據(jù)bco1中蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域和共同區(qū)域蛋白質(zhì)序列，將敲除的目標序列設計在3個轉(zhuǎn)錄本共同對應的保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上，對應于bco1-001轉(zhuǎn)錄本Exon 4和Exon 5(bco1-002：Exon 3和Exon 4; bco1-003：Exon 2和Exon 3)。其中，Exon 4檢測引物為正向引物bco1-4S:5′ATGTAGTTCTGGTCAGGTCA3′；反向引物bco1-4A:5′GTCACGTGGTCAAGTTGTCA 3′；Exon 5檢測引物為正向引物bco1-5S：5′AGGCAAGTTAGGGTAATGAT3′；反向引物bco1-5A：5′TCAACTGCACCACAGAGTAA3′(表1)。

根據(jù)bco1l基因序列信息，得知其Exon 2和Exon 3之間內(nèi)含子較短，而Exon 1和Exon 2之間內(nèi)含子太長，因此將敲除的目標序列設計在Exon 2和Exon 3上，檢測引物為正向引物bco1L2-3S：5′CTTGCCTCCCAGAATTGAC3′；反向引物bco1L2-3A：5′TGTAGTTGACCTCCGATGA3′(表2)。

根據(jù)以上所獲得斑馬魚bco1與bco1l基因的相關信息，分析相關信息發(fā)現(xiàn)，bco1與bco1l基因均位于第7號染色體上，且屬于前后緊密連鎖關系。目前bco1基因已有相關文獻報道，而缺乏關于bco1l基因的相關信息，此次試驗將兩者分開單獨敲除，以便后續(xù)研究確定兩者功能與關系。

圖1 斑馬魚bco1與bco1l基因在基因組上的位置與結(jié)構(gòu)Fig. 1 Locations and genomic structures of bco1 gene and bco1l gene of zebrafish genome

表1 斑馬魚bco1基因Exon 4和Exon 5序列信息Table 1 Sequence information of Exon 4 and Exon 5 of bco1 gene of zebrafish

2.2 sgRNA的設計與有效性的檢測

對于bco1基因，此次位點選擇在所有轉(zhuǎn)錄本共有外顯子中的第二、三個外顯子上，選取表3中sgRNA進行顯微注射，如圖2檢測到有效sgRNA為bco1-gRNA-4與bco1-gRNA-5，在12個單克隆測序結(jié)果中，sgRNA4位點突變樣本有10個，sgRNA5位點突變樣本有12個，兩位點共同突變樣本有10個，且2個sgRNA位點臨近，故選取這2個sgRNA進行批量注射，獲得F0代。

對于bco1l基因，此次位點選擇在第二、三號外顯子上，選取表4中sgRNA進行顯微注射，如圖2檢測到有效sgRNA為bco1l-gRNA-1與bco1l-gRNA-2，在12個單克隆測序結(jié)果中，此2個sgRNA位點突變樣本各有1個，并沒有兩位點共同突變的樣本，2個sgRNA位點有所重疊，故選取這2個gRNA進行批量注射，獲得F0代。

此次實驗成功設計并獲得有效的sgRNA，然而2個基因上的gRNA效率相差非常大：bco1基因上選取的2個sgRNA效率可高達100%，而bco1l基因僅有2個sgRNA檢測到有效，且效率最高也只達到8.33%(表5)。

表2 斑馬魚bco1l基因Exon 2和Exon 3的序列信息Table 2 Sequence information of Exon 2 and Exon 3 of bco1l gene of zebrafish

表3 根據(jù)bco1基因選取的sgRNA靶位點寡核苷酸序列Table 3 Selected sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1 gene

表4 根據(jù)bco1l基因選取的sgRNA靶位點寡核苷酸序列Table 4 Selected sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1l gene

表5 斑馬魚bco1與bco1l基因有效sgRNA靶位點寡核苷酸序列及其效率Table 5 Effective sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1 gene and bco1l gene and their efficiency

圖2 F1代bco1基因篩選過程及突變類型注： (A) F1代部分突變類型凝膠電泳圖，其中M，Marker；WT，Wild type；1#～7#為7種F1代突變個體，各組突變堿基數(shù)為1#，-41/0；2#，-31/0；3#，+37/0；4#，-16/+37；5#，-17/0；6#，+11/0；7#，-1/0。(B) 單克隆前后測序結(jié)果對比圖，其中(1)為4#號雙條帶樣本測序結(jié)果，在突變位點后出現(xiàn)雙峰；(2),(3)為該樣本通過單克隆后的測序結(jié)果，分別與野生型序列進行對比得出圖(C)的結(jié)果。(C) F1代單克隆樣本測序結(jié)果對比所得突變基因型情況，下劃線部分為gRNA位點，藍色標注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。Fig. 2 Screening process and genotypes identified in F1 generation of bco1 mutantsNote: (A) Gel electrophoresis map of part of genotypes found in F1 of bco1 mutants; M, Marker; WT, Wild type; 1#-7#, 7 types of bco1 mutants in F1 generation, number of mutated bases in each type as 1#, -41/0; 2#, -31/0; 3#, +37/0; 4#, -16/+37; 5#, -17/0; 6#, +11/0; 7#, -1/0. (B) Schematics of monocloning sequencing, (1) is the sequencing result of 4# in (A); (2),(3) are the sequencing results of monoclonal samples of 4# in (A), compared with the sequence of wild type, and then obtained (C); (C) NGG (blue) is the PAM (protospacer adjacent motif) sequence. Insertion is highlighted in red and deletion is represented by a dashed line.

圖3 斑馬魚bco1l基因檢測得到的部分突變類型注：下劃線部分為gRNA位點，藍色標注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。Fig. 3 Part of genotypes found in bco1l mutantsNote: NGG (blue) is the PAM (protospacer adjacent motif) sequence. Insertion is highlighted in red and deletion is represented by a dashed line.

2.3 可遺傳突變個體的篩選和獲得

對于基因bco1，F(xiàn)1代篩選過程及檢測所得基因型如圖2，圖中下劃線部分為sgRNA識別位點，藍色標注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。由于該基因所用的2個sgRNA效率較高，而且鄰近，因此獲得較多雙條帶的樣本，挑選雙條帶差距較大的樣本進行測序，確定突變位點，并通過單克隆樣本測序確定兩等位基因的突變情況(見圖3)。由于篩選出了插入37個堿基(+37)和缺失16個堿基(-16)的基因型(-16/+37)突變體，其基因型較為理想，因此以此突變體進行建系，自交得出F2代。

對于基因bco1l，篩選過程同基因bco1，但由于此基因敲除所用sgRNA效率較低，因此得到雙條帶樣本極少，于F1代檢測所得基因型如圖3，圖中下劃線部分為gRNA位點，此處2個gRNA識別序列有4個堿基的重疊，藍色標注為PAM結(jié)構(gòu)(NGG)，紅色標注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。選取插入14個堿基(+14)的基因型(+14/0)突變體進行保種培養(yǎng)，自交得出F2代。

此次試驗中，在選取F0代個體時，通過F0配對自交，制備受精卵基因組DNA模板進行PCR和凝膠電泳驗證，保留在凝膠電泳圖為雙條帶并且突變堿基數(shù)為非3倍數(shù)的親本產(chǎn)卵以培育F1代。F0代自交獲得純合子后代效率理論上比F0代與野生型雜交獲得純合子后代的效率高。但此次在F1代中并沒有獲得足夠的雙突變個體，僅發(fā)現(xiàn)有2條雙突變個體，但是突變類型完全不同，分別為(-16/+37)基因型和(-17/+11)基因型，因此無法配對留做后續(xù)使用。此外，在凝膠電泳圖要得到清晰穩(wěn)定的雙條帶，除了PCR產(chǎn)物大小要控制在100～300 bp外，對引物的特異性也有一定的要求，并不是能夠得出單一野生型條帶的引物就一定能夠獲得清晰穩(wěn)定的雙條帶，與所用的PCR試劑也有一定的關系，需要事先摸索條件加以確定。

斑馬魚bco1基因突變體F2代的基因型檢測中從260尾F2代中共獲得42尾缺失16堿基的突變型(-16/-16)基因型純合子個體，以供后續(xù)研究。并保留10余尾(-16/+37)基因型突變體作為保種培養(yǎng)；bco1l基因突變體F2代的基因型檢測中共檢測出91尾，其中雜合子65尾(+14/0)，野生型26尾(WT)，比例為雜合子：野生型=2.5:1，符合孟德爾遺傳定律，因此可以認為bco1l基因突變純合致死。而此前曾以bco1l基因突變體F2代剛孵出的幼魚進行基因型確認時，檢測出突變純合基因型，比例符合純合子(5尾)：雜合子(10尾)：野生型(3尾)≈1:2:1，因此后續(xù)進一步實驗需確認純合子批量死亡具體時間，才能進行bco1l基因功能的研究。

因此，通過對斑馬魚Ⅰ-細胞期受精卵進行顯微注射Cas9 mRNA與特定的sgRNA，并以yfp-nanos3 mRNA作為顯微注射指示劑，可以有效地對目標基因進行定點編輯，獲得所需的突變類型，并且獲得可穩(wěn)定遺傳個體。

致謝：該研究得到國家科技支撐計劃項目：魚類實驗動物新資源的開發(fā)與標準化研究(2015BAI09B05)資助；感謝珠江水產(chǎn)研究所提供實驗平臺及基礎設施。