郝陽陽 張梁宇 王翔 童云峰 孫穎 陳楊

313000浙江湖州，解放軍第九八醫(yī)院皮膚科［郝陽陽（現(xiàn)在湖州市第一人民醫(yī)院皮膚科，313000）、張梁宇、童云峰、孫穎、陳楊］，藥械科（王翔）

細胞自噬是一種普遍存在于真核細胞中的自我保護機制，通過形成自噬溶酶體來清除失去功能和變性受損的細胞器、大分子物質(zhì)以及入侵的微生物等，以維持細胞的穩(wěn)態(tài)和更新［1-2］。角質(zhì)形成細胞自噬水平降低導致細胞分化不全、炎癥水平升高，參與銀屑病的病理過程［3-4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，喜樹堿可誘導HaCaT細胞自噬，本研究中我們探討喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細胞（human primary keratinocytes，HPK）自噬的影響。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：喜樹堿（含量＞95%，日本東京化成工業(yè)公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶+乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、Epilife培養(yǎng)基、人角質(zhì)形成細胞生長添加劑、慶大霉素/兩性霉素、TrypLE?Express酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。中性蛋白酶Ⅱ（dispaseⅡ），膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-異硫氰酸熒光素（FITC）細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司），CCK8試劑盒（日本同仁化學公司），兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）單克隆抗體（美國Novus公司），兔抗人p62單克隆抗體（美國Proteintech公司），兔抗人角蛋白6單克隆抗體（CK6，英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（美國Santa Cruz公司）。

2.標本：標本來源于2016年5-12月在解放軍第九八醫(yī)院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)的健康成年及青少年男性，共12例，年齡10～23歲。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。

二、方法

1.完全培養(yǎng)基的配制：將5 ml人角質(zhì)形成細胞生長添加劑加入500 ml Epilif培養(yǎng)基中，混勻，分裝。

2.HPK的分離培養(yǎng)：獲取包皮組織后立即放入加有20 mg/L慶大霉素/兩性霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，PBS清洗3次，將組織放入含慶大霉素/兩性霉素的完全培養(yǎng)基中，去除皮下組織，將皮膚組織剪成5 mm ×5 mm小塊，加dispaseⅡ（1.2 U/ml）4℃避光過夜；次日分離表皮和真皮，棄真皮，用0.5%胰酶37℃消化表皮5～10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，在孔徑100 μm的濾網(wǎng)上研磨表皮，過濾、離心，PBS洗滌2次，用含抗生素的培養(yǎng)基重懸細胞，以1×106個/ml的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中；待細胞貼壁，可見細胞成簇生長，2～3 d換液1次，細胞融合度達到80%時，用TrypLE?Express酶消化細胞，傳代。在傳代過程中，逐漸降低培養(yǎng)基中抗生素的濃度。取第3代細胞用于實驗。

3.藥物處理：喜樹堿以DMSO溶解后，-20℃避光保存，存儲濃度為10 mol/L，使用時用完全培養(yǎng)基稀釋成工作濃度。DMSO的終濃度≤0.1%。

4.CCK8檢測細胞增殖抑制率：將對數(shù)生長期HPK以1×104/孔接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，實驗組每孔加入含不同濃度（200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L）喜樹堿的完全培養(yǎng)基100 μl，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，并設置正常對照組（不做任何處理），每組設置6個復孔，分別培養(yǎng)24、48 h后，去除培養(yǎng)液，每孔加入含10 μl CCK8的培養(yǎng)液100 μl。同時設空白組，不加細胞，只加含10 μl CCK8的培養(yǎng)液100 μl。37 ℃、5%CO2條件下孵育2 h，酶標儀檢測450 nm波長下吸光度（A值）。細胞增殖抑制率=［1-（實驗組A450值-空白組A450值）/（正常對照組A450值-空白組A450值）］×100%。實驗重復3次，取均值。

5.Annexin-FITC/碘化丙錠（PI）雙染法檢測細胞凋亡：細胞分組及處理同方法“二、4”，處理細胞24 h后檢測細胞凋亡。方法同文獻［5］。以Annexin V陽性細胞為凋亡細胞。

6.免疫印跡法檢測LC3、p62蛋白的表達水平：細胞分組及處理同上，處理細胞24 h后進行檢測，方法同文獻［5］。

7.間接免疫熒光法檢測LC3：細胞分為兩組，對照組（用含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基處理）和2 μmol/L喜樹堿組，處理24 h后檢測，方法同文獻［5］。在細胞質(zhì)或細胞核周圍觀察到3個或以上高密度的綠色熒光點即判定為自噬體陽性細胞。隨機在熒光顯微鏡下選取5個200倍視野，統(tǒng)計每個視野中自噬體陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分率，取均值。

8.透射電鏡觀察細胞自噬超微結(jié)構(gòu)：將HPK以1×105/ml的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每皿加10 ml完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，去除上清液，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，實驗組加入含2 μmol/L喜樹堿的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用2.5%戊二醛4℃固定細胞過夜，PBS洗滌3次，加入1%鋨酸于4℃下振蕩固定3 h，PBS洗滌3次，乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換，Suprr樹脂浸透包埋，最后在70℃烘箱中聚合。將不同材料的包埋塊在超薄切片機上切片，厚度70 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察并拍照。

9.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。各均數(shù)經(jīng)Levene檢驗方差齊性。不同濃度喜樹堿組細胞增殖抑制率以及凋亡的總體差異采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnettt檢驗，自噬體陽性細胞率采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、不同濃度喜樹堿對HPK增殖的影響

對照組和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿組HPK增殖抑制率（表1）在24 h時總體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），2 μmol/L、6 μmol/L組抑制率顯著高于對照組（t=12.09、18.76，均P＜ 0.01），200 nmol/L組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（t=2.24，P＞0.05）。48 h時各組增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），各實驗組抑制率均高于對照組（t=4.27、13.63、16.83，均P＜ 0.01）。

二、不同濃度喜樹堿對HPK凋亡的影響

對照組、200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿組24 h時凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），實驗組凋亡率均高于對照組（t=6.19、12.30、15.01，均P＜0.01）），隨著藥物濃度增加，促凋亡作用增強。見表1。

三、喜樹堿作用于HPK后LC3、p62蛋白的表達

不同濃度喜樹堿作用HPK 24 h后，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ在喜樹堿濃度為2、6 μmol/L時表達顯著上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；p62蛋白在2、6 μmol/L組輕度下調(diào)，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1、圖1。在喜樹堿濃度為2 μmol/L時，LC3-Ⅱ蛋白顯著上調(diào)，提示在此濃度時細胞自噬水平升高，因此選取該組細胞觀察自噬體及其超微結(jié)構(gòu)。

四、喜樹堿對HPK自噬體陽性細胞的影響

2 μmol/L喜樹堿作用HPK 24 h后，LC3間接免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，細胞核周及胞質(zhì)呈現(xiàn)高密度綠色熒光點，實驗組綠色熒光強度較對照組明顯增強，對照組細胞胞質(zhì)內(nèi)也存在數(shù)量較多的熒光聚集點，見圖2。對照組和實驗組自噬體陽性細胞百分率分別為（38.96±13.12）%、（60.16±8.78）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=3.003，P＜ 0.05）。

表1 不同濃度喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細胞增殖抑制率、凋亡率及LC3、p62蛋白表達的影響（±s）

表1 不同濃度喜樹堿對人原代角質(zhì)形成細胞增殖抑制率、凋亡率及LC3、p62蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較，P＜0.01

組別24 h凋亡率（%）對照組200 nmol/L喜樹堿組2 μmol/L喜樹堿組6 μmol/L喜樹堿組F值P值增殖抑制率（%）24 h 1.60±0.78 7.59±1.82 33.90±3.65a 51.72±5.06a 152.9＜0.01 48 h 4.18±1.56 19.21±5.74a 52.09±3.01a 63.37±5.45a 123.8＜0.01 2.30±1.68 15.90±2.14a 29.33±3.51a 35.28±3.05a 89.57＜0.01自噬相關(guān)蛋白與β肌動蛋白灰度比值LC3-Ⅱ0.747±0.045 0.690±0.052 1.213±0.063a 1.292±0.057a 97.52＜0.01 p62蛋白1.203±0.133 1.287±0.117 0.905±0.103a 0.904±0.046a 9.47＜0.01

五、喜樹堿處理24 h后HPK內(nèi)自噬體超微結(jié)構(gòu)

2μmol/L喜樹堿組細胞胞質(zhì)內(nèi)可見較多高電子密度的由雙層或單層膜包裹的囊泡樣結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)內(nèi)為胞質(zhì)成分，部分囊泡內(nèi)可見損傷的細胞器成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；對照組胞質(zhì)內(nèi)細胞內(nèi)容物均一，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器結(jié)構(gòu)清晰，囊泡樣結(jié)構(gòu)相對較少。見圖3。

討 論

圖1 不同濃度喜樹堿作用人原代角質(zhì)形成細胞24 h后LC3、p62蛋白表達

圖2 LC3間接免疫熒光觀察人原代角質(zhì)形成細胞自噬體的形成

圖3 人原代角質(zhì)形成細胞自噬體超微結(jié)構(gòu)

因HPK培養(yǎng)周期長、細胞穩(wěn)定性難以保證、培養(yǎng)基昂貴，既往對于角質(zhì)形成細胞的研究多采用人角質(zhì)形成細胞系HaCaT。HaCaT細胞與HPK在細胞形態(tài)、生長周期以及對外界刺激反應方面均存在較大差異。實驗中HaCaT細胞增殖明顯較HPK快，在抵御外界刺激如紫外線時，易受外界刺激損傷，而HPK更耐受中波紫外線照射引起的損傷，在細胞自噬水平上兩者也不同，HPK的基礎自噬水平遠高于HaCaT細胞［6］。上述差異說明，HaCaT細胞不能較好地代表人角質(zhì)形成細胞的正常生理狀態(tài)。因此，使用HPK能充分模擬人生理條件下的角質(zhì)形成細胞，在細胞生物學研究中HPK的參考價值更高。

我們前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，5、10 nmol/L喜樹堿可誘導HaCaT細胞發(fā)生自噬，對細胞增殖、凋亡無顯著影響，50、100、200 nmol/L喜樹堿抑制 HaCaT細胞增殖，促使細胞發(fā)生凋亡，自噬水平降低。本研究中2、6 μmol/L喜樹堿可明顯抑制HPK增殖，200 nmol/L喜樹堿作用24 h對細胞增殖無顯著影響，但作用48h對細胞增殖產(chǎn)生部分抑制。200nmol/L、2μmol/L、6 μmol/L喜樹堿作用細胞24 h，均可誘導細胞凋亡。在細胞自噬方面，2 μmol/L、6 μmol/L喜樹堿作用24 h可誘導HPK產(chǎn)生自噬，自噬相關(guān)LC3蛋白表達量明顯增加，p62蛋白水平輕度下降，間接免疫熒光、透射電鏡均證明喜樹堿可誘導HPK自噬水平升高。p62蛋白是一種支架蛋白，在自噬小體形成過程中其作為連接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，通過泛素信號途徑將變性蛋白、受損的細胞器以及入侵細胞的微生物轉(zhuǎn)運到自噬小體進行降解［6］。自噬抑制可導致p62聚集，自噬水平升高時p62降解增加，因此p62蛋白的多少可以作為自噬流的測定指標［7］。本研究還表明，HPK基礎自噬水平較高，與以往研究一致［8］。喜樹堿抑制HPK增殖、誘導凋亡及自噬的藥物濃度均較HaCaT細胞（自噬誘導濃度5 ～ 10 nmol/L，凋亡誘導濃度 50 nmol/L）［5］明顯增加，提示HPK對喜樹堿有較好的耐受性，而HaCaT細胞易受到藥物損傷，兩者對藥物反應性不同。這種差異性與細胞本身性質(zhì)不同有關(guān)。

細胞在正常生理狀態(tài)下存在一定水平的自噬，以維持細胞內(nèi)物質(zhì)的更新，促進細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡［9］。自噬在維持角質(zhì)形成細胞正常功能中起重要作用，自噬水平下降可導致角質(zhì)形成細胞的異常增殖、分化和炎癥［3-4，10］，而銀屑病的發(fā)病與角質(zhì)形成細胞的異常增殖、分化及炎癥密切相關(guān)。Akinduro等［11］研究發(fā)現(xiàn)，自噬在皮膚顆粒層的形成中起關(guān)鍵作用，胎鼠皮膚在顆粒層形成之前，基底層和棘層細胞自噬相關(guān)蛋白LC3、自噬相關(guān)蛋白1（ATG1）、beclin1、自噬相關(guān)蛋白（ATG）5-ATG12復合物表達水平低，而顆粒層的形成伴自噬相關(guān)蛋白的顯著升高。細胞自噬在角質(zhì)形成細胞的終末分化中起重要的作用，在角質(zhì)層細胞核逐漸消失的過程中，核自噬（nucleophagy）是其主要機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）缺陷可使角質(zhì)形成細胞抵抗內(nèi)外氧化應激功能嚴重受損，并且導致了DNA損傷［12］。

在角質(zhì)形成細胞的老化過程中，衰老的細胞并非死于凋亡，而是死于高水平的自噬活動［13-14］。喜樹堿可通過抑制端粒酶的活性誘導正常細胞啟動凋亡程序，還可通過腫瘤壞死因子α和Fas/Fas L途徑誘導腫瘤細胞直接凋亡［15］。在HPK中，喜樹堿誘導細胞自噬的同時，細胞凋亡增加，可能出現(xiàn)了自噬性程序性死亡，也可能同時出現(xiàn)了自噬和凋亡。但自噬和凋亡在原代角質(zhì)形成細胞和HaCaT細胞中的相互關(guān)系并不相同。

總之，喜樹堿可誘導HPK產(chǎn)生自噬，提高角質(zhì)形成細胞的自噬水平。然而，喜樹堿誘導原代角質(zhì)形成細胞自噬的機制以及自噬與凋亡的關(guān)系有待進一步研究。