趙永魁，王曉濤，陳建立，王長友，張國志

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌是最常見的一種類型，約占80%。近年來我國甲狀腺癌發(fā)病率持續(xù)上升，是增長速度最快的惡性腫瘤[1]。目前針對分化較好、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌，主要是通過手術(shù)聯(lián)合131I放療及內(nèi)分泌治療，可獲得較好的預(yù)后[2]。然而對已發(fā)生131I耐受或遠處轉(zhuǎn)移的乳頭狀癌、未分化癌和髓樣癌來說，傳統(tǒng)治療效果不佳[3]。同時手術(shù)治療可能存在神經(jīng)副損傷及術(shù)后瘢痕影響美觀等不足。因此，甲狀腺癌藥物治療相關(guān)研究具有較大的臨床意義及前景。甲狀腺癌的發(fā)病機制尚不明確，有研究表明與細胞自噬有關(guān)[4]。自噬是細胞利用自噬-溶酶體系統(tǒng)對受損或壞死細胞器進行水解，將分解所得到的產(chǎn)物供細胞再利用的過程。自噬對細胞生長發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義，同時也與疾病的發(fā)生有關(guān)[5]。大量文獻[6]表明，自噬功能障礙與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。雷帕霉素是一種真核生物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑，可通過抑制mTOR誘發(fā)自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)作為自噬經(jīng)典抑制劑，可通過對PI3K的作用影響自噬體形成，阻斷自噬[8]。本研究觀察了雷帕霉素作用后人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞增殖、遷移能力變化，并觀察了自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的表達情況，為闡明自噬與甲狀腺癌的關(guān)系及雷帕霉素在甲狀腺癌治療中的運用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 甲狀腺乳頭狀癌K1細胞購自中國科學(xué)院干細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。雷帕霉素、3-MA購自北京索萊寶公司。兔抗人p62抗體、LC3抗體購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗、GAPDH抗體、MTT細胞增殖毒性檢測試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(ECL)均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。酶標儀、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)購自上海Bio-Rad公司。12孔Transwell小室購自北京索萊寶公司。

1.2 雷帕霉素溶液、3-MA溶液的配制及適宜作用濃度篩選 ①雷帕霉素溶液配制：按說明書用二甲基亞砜(DMSO)將雷帕霉素配制成濃度為100 mmol/L的溶液，使用前用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基RPMI1640稀釋成濃度為100 μmol/L的溶液。②3-MA溶液配制：按說明書用DMSO將3-MA溶解，配制成濃度為200 mmol/L的溶液備用。③雷帕霉素適宜作用濃度篩選：K1細胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)；取生長狀態(tài)良好的細胞用0.25%胰酶消化制成1×105/mL的細胞懸液，每孔加入100 μL接種于96孔板，分為A、B、C、D、E、F組，每組設(shè)4個復(fù)孔；24 h后更換培養(yǎng)基，A組加入100 μL的培養(yǎng)基，B組加入99 μL培養(yǎng)基+1 μL雷帕霉素，C組加入95 μL培養(yǎng)基+5 μL雷帕霉素，D組加入90 μL培養(yǎng)基+10 μL雷帕霉素，E組加入85 μL培養(yǎng)基+15 μL雷帕霉素，F(xiàn)組加入80 μL培養(yǎng)基+20 μL雷帕霉素；培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的DMSO，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，應(yīng)用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度值(OD值)。結(jié)果顯示不同濃度雷帕霉素對K1細胞增殖均有抑制作用，且隨著雷帕霉素濃度升高，細胞存活率逐漸降低。以時間為橫軸、以細胞存活率為縱軸繪制細胞存活曲線。利用存活曲線得出雷帕霉素半抑制濃度(IC50)為10 μmol/L，以此作為實驗濃度。為保證3-MA對細胞無毒性作用，要求3-MA終濃度為1 mmol/L。

1.3 細胞分組及處理 取生長狀態(tài)良好的K1細胞用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔取2 mL細胞懸液接種于3個6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度達80%開始實驗。將K1細胞分為對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+3-MA組。對照組不做任何處理，加入2 mL培養(yǎng)基；雷帕霉素組加入100 μmol/L雷帕霉素0.2 mL及培養(yǎng)基1.8 mL；雷帕霉素+3-MA組先加入100 μmol/L雷帕霉素200 μL及培養(yǎng)基1.79 mL，1 h后加入1 mmol/L 3-MA溶液10 uL。上述各組細胞繼續(xù)置于恒溫箱中培養(yǎng)24 h。

1.4 各組細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取各組生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰酶消化制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔加入100 μL接種于4個96孔板，每組取4個復(fù)孔。置于恒溫箱中培養(yǎng)，分別于24、48、72、96 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中反應(yīng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的OD值，代表細胞增殖能力。

1.5 各組細胞遷移能力檢測 采用Transwell法。取各組生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%胰酶消化，用不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基稀釋成密度為2×106/mL的細胞懸液。取100 μL的細胞懸液加入Transwell上室內(nèi)，下室加入高濃度FBS(20%)培養(yǎng)基800 mL，置恒溫箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，用小刀將膜取下，穿過細胞膜的細胞細胞用HE染色。100倍顯微鏡下隨機挑選5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.6 各組細胞中LC3、p62蛋白檢測 采用Western blotting法。提取各組細胞細胞蛋白經(jīng)定量、變性后于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明配制12%分離膠、6%濃縮膠，蛋白上樣量40 μg，90 V恒壓電泳1 h，采用恒壓濕轉(zhuǎn)(p62蛋白為90 V、60 min，LC3蛋白為90 V、20 min)。配制10%脫脂牛奶，將膜置于10%脫脂牛奶中搖床封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，加入二抗(1∶1 000)室溫 2 h，TBST溶液洗膜3次、每次10 min，ECL熒光顯色。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖能力比較 培養(yǎng)48、72、96 h后，雷帕霉素組細胞增殖能力低于對照組，雷帕霉素+3-MA組細胞增殖能力高于雷帕霉素組(P均<0.01)。詳見表1。

表1 各組細胞OD值比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與雷帕霉素組相比，#P<0.01。

2.2 各組細胞侵襲能力比較 對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數(shù)為分別為(310.4±5.7)、(100.4±4.5)、(292.2±4.6)個/視野，雷帕霉素組穿膜細胞數(shù)少于對照組，雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數(shù)多于雷帕霉素組(P均<0.01)。見圖1。

圖1 各組穿膜細胞情況

2.3 各組細胞中p62、LC3蛋白表達比較 對照組、雷帕霉素組及雷帕霉素+3-MA組中p62蛋白相對表達量分別為1.215±0.106、0.232±0.025、0.876±0.054，LC3蛋白相對表達量分別為0.091±0.012、1.980±0.095、0.363±0.058。雷帕霉素組LC3蛋白相對表達量高于對照組，p62蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.01)；雷帕霉素+3MA組LC3蛋白相對表達量低于雷帕霉素組，p62蛋白相對表達量高于雷帕霉素組(P均<0.01)。見圖2。

圖2 各組細胞中LC3、p62蛋白電泳條帶

3 討論

甲狀腺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，以女性多見，男女發(fā)病比例1∶3。有研究[4]表明甲狀腺癌的發(fā)病與細胞自噬有關(guān)。細胞自噬功能近年來受到了較多關(guān)注。自噬通過去除功能失調(diào)或受損的細胞成分并回收必需的細胞成分，在穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用[10]。自噬功能障礙與腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展密不可分[6]。自噬在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)雙重作用：在高度侵襲性惡性腫瘤中，僅通過血管生成和有氧糖酵解是無法滿足惡性腫瘤的高代謝，因此需激活替代代謝途徑，通過自噬被循環(huán)以提供細胞能量來源[11]；然而，隨著細胞成分逐漸消耗，無限制的自噬最終導(dǎo)致細胞死亡[12]。因此，自噬既可以維持腫瘤細胞的生長和發(fā)展，也可以因自噬作用過度引起“自噬性死亡”從而抑制腫瘤細胞生長[13,14]。

雷帕霉素是真核生物mTOR最常見的抑制劑。mTOR是調(diào)節(jié)細胞生長和周期的關(guān)鍵蛋白，可通過磷酸化核糖體激酶S6K和真核生物起始因子4E-BP1從而促進細胞生長。當mTORC1活性被抑制后，下游分子4E-BP1和S6K被抑制，cyclin D1、HIF-1活性降低，抑制細胞周期、細胞生長和新血管生成[15]。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可對骨肉瘤細胞生長產(chǎn)生抑制作用。研究[17]表明，在很多腫瘤細胞中存在編碼mTOR蛋白基因突變，使腫瘤細胞中mTOR過度表達。在甲狀腺癌細胞的生長、增殖過程中，PI3K-AKT-mTOR信號通路發(fā)揮重要作用[18]。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)48、72、96 h后，雷帕霉素組細胞增殖能力低于對照組，雷帕霉素+3-MA組細胞增殖能力高于雷帕霉素組；雷帕霉素組穿膜細胞數(shù)少于對照組，雷帕霉素+3-MA組穿膜細胞數(shù)多于雷帕霉素組。上述結(jié)果表明雷帕霉素對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移能力有抑制作用。有報道[19]稱，mTOR具有抑制自噬等功能。Eum等[20]研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素發(fā)揮抗腫瘤作用是通過抑制mTOR誘發(fā)自噬來完成的。因此推測雷帕霉素對K1細胞增殖、遷移能力的抑制作用可能與自噬有關(guān)。

3-MA是自噬經(jīng)典抑制劑[8]。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)加入3-MA后細胞增殖能力及遷移能力均較雷帕霉素組明顯增強，進一步提示雷帕霉素抑制K1細胞增殖、遷移能力與自噬有關(guān)。在涉及自噬過程的各種蛋白中，LC3參與延伸并促成自噬體形成[11]；p62是一種自噬特異性底物，可將泛素化蛋白轉(zhuǎn)移至自噬體[21]，其蛋白序列上有一特殊區(qū)域能夠被LC3識別，其與LC3相互作用不斷被自噬-溶酶體系統(tǒng)降解[22]。因此LC3、p62是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在較為可靠的生物學(xué)標志物。我們進一步檢測了各組細胞中自噬相關(guān)蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素組LC3蛋白相對表達量高于對照組，p62蛋白相對表達量低于對照組；雷帕霉素+3-MA組LC3蛋白相對表達量低于雷帕霉素組，p62蛋白相對表達量高于雷帕霉素組。上述結(jié)果提示雷帕霉素作用后細胞自噬增強，而加入自噬抑制劑后細胞自噬被抑制，進一步驗證了上述結(jié)論。

綜上所述，雷帕霉素作用后甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移能力受到抑制，其機制可能與誘發(fā)自噬有關(guān)，具體機制有待進一步研究證實。