梁文花，賈云慧，許程志，吳運譜，陳 艷，楊煥良，喬傳玲，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室，哈爾濱 150069)

豬流感(swine influenza, SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus, SIV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。豬群中廣泛流行的SIV主要有3種亞型H1N1、H1N2和H3N2，其中H1N1病毒又分為經(jīng)典型、類人型、類禽型和2009/H1N1 4個基因譜系[1]。類禽型H1N1流感在20世紀(jì)70年代末首次出現(xiàn)于歐洲豬群，病原是由感染禽類傳播到豬群中之后廣泛流行[2]，目前該類病毒在歐洲及亞洲多個國家的豬群中廣泛流行，被稱之為歐亞類禽型(Eurasian avian-like，EA)H1N1 SIV[3-4]，并且出現(xiàn)了感染人的零星報道[5-6]。本實驗室在2005年分離到第一株EA H1N1(A/swine/Henan/11/2005)，近10多年 SI的病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)EA H1N1已逐步成為主要的流行毒株，部分毒株已具備了在哺乳動物間高效傳播的能力[7]，大大凸顯了EA H1N1病毒重要的獸醫(yī)學(xué)及公共衛(wèi)生學(xué)意義。

作為流感病毒重要的膜蛋白之一，血凝素(hemagglutinin，HA)具有與細(xì)胞表面病毒特異性受體結(jié)合、介導(dǎo)病毒外膜與細(xì)胞內(nèi)體融合，以及刺激機體產(chǎn)生中和抗體等作用[8-9]。HA蛋白誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體作為抗病毒免疫的首要因素，能夠在第一時間與病毒結(jié)合，從而抑制病毒對細(xì)胞的入侵，在抗病毒治療及其免疫等方面都發(fā)揮著重要作用[10]。已有研究結(jié)果表明中和性單克隆抗體(monoclonal antibody, MAb)作為一種有效的技術(shù)手段可用于防制流感病毒感染的發(fā)生[11]。因此，本研究以純化的全病毒蛋白作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)篩選制備針對HA蛋白的、具有中和活性的MAb，并對其體內(nèi)外中和病毒感染的活性進(jìn)行了檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及實驗動物等

H1N1亞型SIV A/swine/Henan/11/2005(HN11，GenBank登錄號為HQ541672～HQ541679)、A/swine/Guangxi/18/2011(GX18)、A/swine/Zhejiang/245/2013(ZJ245)、A/swine/Guangdong/306/2013(GD306)、A/swine/Liaoning/FS176/2015(FS176)、A/swine/Heilongjiang/44/2009(HLJ44)和H3N2 亞型SIV A/swine/Guangdong/9/2005(GD5)均由本實驗室分離、鑒定并保存。H5、H7及H9亞型禽流感病毒(AIV)HI試驗抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，表達(dá)病毒HN11 HA蛋白的重組質(zhì)粒pCAGGS-H1HA、抗HN11毒株的小鼠多克隆血清、骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和293T細(xì)胞由本實驗室保存。6和8周齡的雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購于Gibco公司；弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)，選擇培養(yǎng)基HAT、HT，融合劑PEG2000，F(xiàn)ITC-Mouse 熒光二抗及羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗均購于Sigma公司；Clonotyping Systerm/HRP Kit亞型鑒定試劑盒購自SBA公司；IRDye800CW羊抗鼠IgG抗體購自LI-COR公司，Protein G親和層析柱購自GE healthcare公司。

1.3 免疫原制備

將 HN11毒株進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取10-3、10-4、10-53個稀釋度的病毒液接種10日齡的非免疫雞胚，72 h后收取尿囊液測定其HA效價，收集HA效價在1∶128以上的尿囊液，將其于4 ℃條件下8 000 r·min-1離心30 min；取上清液于4 ℃ 30 000 r·min-1離心2 h；棄上清，并取適量PBS(pH=7.4)懸浮沉淀。配制20%、40%、60%的蔗糖溶液，將上述得到的病毒液采用蔗糖密度梯度35 000 r·min-1離心3 h。取40%～60%的全病毒蛋白，取適量PBS再次溶解，35 000 r·min-1離心2 h進(jìn)行脫糖。最后，用適量PBS重懸沉淀，β-丙 內(nèi)酯滅活，測定其蛋白含量，分裝，-20 ℃保存，在后續(xù)試驗中分別用作免疫原及MAb的篩選與鑒定。

1.4 動物免疫

按照文獻(xiàn)[12]的方法，將純化的蛋白與等體積的FCA乳化均勻后，經(jīng)皮下多點注射免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，接種劑量為100 μg·只-1。之后每隔兩周將FICA乳化的抗原經(jīng)腹腔注射進(jìn)行第2次與第3次免疫。融合前的3 d再次加強免疫。

1.5 雜交瘤細(xì)胞的制備與篩選

將純化的HN11全病毒蛋白、鼠抗HN11病毒多克隆陽性血清及陰性血清分別進(jìn)行倍比稀釋，采取棋盤法確定間接ELISA中抗原的最佳包被濃度與抗體的最佳反應(yīng)濃度。判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性血清孔OD450 nm接近1.0，陰性血清孔OD450 nm<0.2，且P/N>2.1時的反應(yīng)條件，確定為最佳工作濃度。

參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行細(xì)胞融合、篩選、亞克隆。按照常規(guī)方法將免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞在PEG2000的作用下按4∶1比例進(jìn)行融合。待細(xì)胞集落長到培養(yǎng)孔1/3～1/2大小時，通過ELISA和HI試驗方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。對篩選到的陽性孔細(xì)胞再進(jìn)行2～3次亞克隆和檢測, 直到所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清ELISA和HI均為陽性為止。

1.6 腹水的制備與純化

采用8周齡的BALB/c小鼠腹腔注射FICA，每只0.5 mL。1周后，每只小鼠腹腔注射105個陽性雜交瘤細(xì)胞，密切觀察小鼠腹部明顯膨大，適時收集腹水，將收集的腹水以5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，利用Protein G親和層析法純化抗體。具體步驟如下：取0.5 mL MAb 5 000 r·min-1離心10 min以去除油脂層，取上清；將所獲上清用5倍體積的Binding Buffer (20 mmol·L-1Na3PO4, pH=7.0)稀釋，過親和層析柱，流速約為1 mL·min-1；用10倍柱體積的Binding Buffer清洗柱子，以去除雜質(zhì)；用5 mL的Elution Buffer (PBS，0.1 mol·L-1Gly，pH=2.7) 洗脫結(jié)合在親和層析柱上的抗體，流速約為0.5 mL·min-1，收集洗脫液；紫外分光光度計280 nm測定蛋白濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 MAbs生物學(xué)活性的檢測

1.7.1 亞類鑒定 將“1.6”中收集得到的MAbs腹水按照Clonotyping Systerm/HRP Kit試劑盒說明書中具體的步驟進(jìn)行MAb亞類的鑒定。

1.7.2 ELISA和HI效價的測定 將上述制備的HN11毒株作為ELISA包被抗原和HI檢測抗原，對分泌MAbs的雜交瘤細(xì)胞上清以及MAbs腹水進(jìn)行間接ELISA及HI試驗，測定其ELISA及HI效價。

1.7.3 Western blot對MAbs活性分析 將純化的全病毒蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，并用制備MAbs作為一抗(1∶1 000)，以 IRDye800CW羊抗鼠IgG抗體作為二抗(1∶8 000)，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜進(jìn)行Western blot鑒定。

1.7.4 免疫熒光(IFA)對MAbs活性的檢測 將表達(dá)HN11 HA蛋白的重組質(zhì)粒pCAGGS-H1HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后用70%的冰乙醇固定細(xì)胞20 min，以獲得的MAb作為一抗，二抗為羊抗鼠FITC-IgG，按照常規(guī)方法進(jìn)行孵育，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.7.5 MAbs對不同分支H1亞型SIV及其他亞型流感病毒HI交叉反應(yīng)活性的檢測 分別將制備的MAbs與EA H1N1、2009/H1N1、含有EA H1N1HA基因的重配型H1N1、H3N2病毒及H5、H7、H9亞型AIV的HI試驗抗原進(jìn)行反應(yīng)，測定MAbs對不同病毒的HI反應(yīng)活性。

1.7.6 MAbs對不同分支H1亞型SIV中和活性的檢測 選取EA H1N1、2009/H1N1、含有EA H1N1HA基因的重配型H1N1病毒，分別測定其TCID50，將MAbs 按照1∶10、1∶20、1∶40……1∶10 240作2倍倍比稀釋后與100 TCID50的病毒混合，37 ℃作用1 h，然后將其接種于80%鋪滿的MDCK單層細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，期間觀察細(xì)胞病變情況，72 h后測定細(xì)胞上清的HA活性，根據(jù)結(jié)果再計算MAbs的中和效價。

1.7.7 MAbs對病毒感染小鼠的免疫保護性 將MAbs分別按照小鼠體重20 μg·g-1的劑量接種6周齡BALB/c小鼠，24 h后，接種及未接種MAbs的小鼠分別再次分組(其中一組為正常對照)，分別選取與制備MAbs時用到的免疫原病毒同源病毒株HN11與異源病毒株GD306進(jìn)行滴鼻感染，感染劑量為106EID50，感染后14 d內(nèi)每天稱量小鼠體重，并在感染后第3 天，隨機剖殺其中的3只小鼠，取肺和鼻甲骨勻漿后接種10日齡的非免疫雞胚，測定其病毒含量。

2 結(jié) 果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的制備

以純化的HN11全病毒蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法。確定抗原的最佳包被濃度為8 μg·mL-1；血清最佳稀釋度為1∶1 600，最佳作用時間為37 ℃孵育1 h；二抗稀釋度為1∶5 000，最佳作用時間為37 ℃孵育1 h。免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞經(jīng)過融合，利用ELISA方法和HI試驗篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞， 經(jīng)3次亞克隆后，共獲得兩株能夠穩(wěn)定分泌抗HA蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B6和4C7。

2.2 MAbs的亞類鑒定

利用試劑盒Clonotyping Systerm/HRP Kit對兩株MAbs的亞類進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，單抗2B6和4C7的重鏈分別為 IgG2a和IgG2b，其輕鏈均為κ鏈。

2.3 MAbs的ELISA及HI效價測定

利用ELISA和HI試驗分別檢測MAbs的效價，結(jié)果顯示2B6和4C7兩株MAbs的細(xì)胞上清均檢測到ELISA和HI效價，其制備腹水的效價均有所提高(表1)。

表1兩株MAbs的ELISA和HI效價

Table1ThetitersofELISAandHIoftwoMAbs

單抗MAbsELISA 效價 ELISA titersHI效價 HI titers細(xì)胞上清 Supernatants腹水 Ascites細(xì)胞上清 Supernatants腹水 Ascites2B61∶1051∶1095log29log24C71∶1041∶1073log25log2

2.4 Western blot與IFA對MAbs 活性的檢測

分別采用兩株MAbs 2B6和4C7作為一抗，對純化的HN11全病毒蛋白進(jìn)行檢測，同時用抗HN11病毒的陽性血清作為檢測對照，結(jié)果顯示用多克隆血清作為檢測一抗，在56 ku處有明顯的特異性條帶，而兩株MAbs檢測時在相應(yīng)的位置均未見反應(yīng)條帶(圖1)，表明兩株MAbs不能與HA蛋白發(fā)生反應(yīng)，提示2B6和4C7可能為識別HA蛋白構(gòu)象表位的MAbs。

將重組質(zhì)粒pCAGGS-H1HA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，IFA檢測結(jié)果顯示，兩株MAbs與pCAGGS-H1HA在細(xì)胞中瞬時表達(dá)的HA蛋白反應(yīng)均能出現(xiàn)亮綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCAGGS的對照細(xì)胞未見熒光(圖2)，表明兩株MAbs與靶抗原HA蛋白均具有良好的反應(yīng)活性。

2.5 MAbs對不同分支H1亞型SIV及其他亞型流感病毒的HI交叉反應(yīng)活性

選取不同的病毒及抗原分別配制4單位抗原，與MAbs分別進(jìn)行HI試驗，結(jié)果顯示兩株MAbs與EA H1N1病毒及含有EA H1N1HA基因的重配型H1N1病毒HI反應(yīng)效價較高，同時對H3N2病毒和H9抗原也有反應(yīng)，而與HLJ44、H5和H7抗原不發(fā)生反應(yīng)(表2)。表明除了EA H1N1病毒外，MAbs對H3N2及H9N2亞型的病毒也具有一定的HI交叉反應(yīng)活性。

2.6 MAbs對不同分支H1亞型SIV中和活性的測定

將兩株MAbs分別與100TCID50的病毒進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示2B6和4C7對HN11的中和效價顯示較高，分別達(dá)到1∶709.6和1∶446.7；對其他兩株EA H1N1和重配型病毒GD306也具有一定的中和活性，而不能中和病毒FS176和HLJ44(表3)。表明MAbs對不同分支H1N1病毒的中和活性存在較大差異。

M. 預(yù)染的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 多克隆血清與純化的全病毒蛋白反應(yīng)； 2. 單抗2B6與純化的全病毒蛋白反應(yīng)；3. 單抗4C7與純化的全病毒蛋白反應(yīng)M. Prestained protein ladder; 1. Polyclonal serum reacted with the purified whole virus protein; 2. MAb 2B6 reacted with the purified whole virus protein; 3. MAb 4C7 reacted with the purified whole virus protein圖1 Western blot對MAbs的活性檢測Fig.1 Activity analysis of MAbs by Western blot

a.單抗2B6檢測pCAGGS-H1HA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；b.單抗4C7檢測pCAGGS-H1HA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；c.單抗2B6檢測pCAGGS轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞；d.單抗4C7檢測pCAGGS轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞反應(yīng)a. MAb 2B6 detected 293T cells transfected with pCAGGS-H1HA; b. MAb 4C7 detected 293T cells transfected with pCAGGS-H1HA; c. MAb 2B6 detected 293T cells transfected with pCAGGS; d. MAb 4C7 detected 293T cells transfected wirh pCAGGS圖2 IFA對兩株 MAbs 的活性檢測(200×)Fig.2 Activity analysis of the two MAbs by IFA(200×)

表2兩株MAbs對不同H1亞型SIVs及其他亞型流感病毒(或抗原)的HI效價

Table2TheHItitersofthetwoMAbsagainstthedifferentH1subtypeSIVsandothersubtypeinfluenzaviruses

單抗MAbs與不同流感病毒(或抗原)的HI反應(yīng)效價(log2)The HI titers against different influenza viruses or antigens (log2)HN11GX18ZJ245GD306FS176HLJ44H3N2H5H7H92B698868-6--44C753443-4--3

HN11、GX18和ZJ245為EA H1N1 SIV；GD306和FS176是含有EA H1N1HA基因的重配型H1N1 SIV，HLJ44為2009/H1N1病毒；- 表示對病毒(或抗原)HI反應(yīng)陰性

HN11, GX18 and ZJ245 are EA H1N1 SIVs; GD306 and FS176 are reassortant H1N1 SIVs containingHAgene derived from EA H1N1 viruses; HLJ44 is 2009/H1N1 virus; - indicated the negative result of HI test against different influenza viruses or antigens

表3兩株MAbs對不同H1亞型病毒的中和效價

Table3NeutralizingactivityoftwoMAbsagainstthedifferentH1subtypeSIVs

單抗MAbs與不同H1亞型病毒的中和效價Neutralizing activity of two MAbs against different influenza viruses HN11GX18ZJ245GD306FS176HLJ442B61∶709.61∶89.31∶44.71∶70.6--4C71∶446.71∶44.71∶28.21∶44.7--

- 表示對病毒沒有中和活性

- indicated that there is no neutralizing activity of two MAbs against the influenza viruses

2.7 MAbs對病毒感染小鼠的免疫保護效果

在病毒感染前24 h，對部分試驗小鼠分別接種兩株MAbs。病毒感染后持續(xù)監(jiān)測小鼠的體重，并于感染后第3天測定感染小鼠肺中的病毒含量。結(jié)果顯示，未接種MAbs的小鼠，分別在感染HN11和GD306病毒后體重出現(xiàn)明顯的下降，最大下降比率分別達(dá)到 8.2%和10.7%；同時，肺中均檢測到病毒復(fù)制，其滴度分別為3.23和3.58log10EID50·mL-1，鼻甲中的病毒復(fù)制滴度分別為1.25和2.5log10EID50·mL-1。而兩組MAbs注射小鼠獲得了對同源HN11病毒感染的完全保護，未見體重下降與病毒檢出(圖3a)；異源GD306病毒感染時，相比于對照組小鼠，注射MAbs的小鼠其體重下降的比例均顯著降低，與此同時，肺和鼻甲骨中的病毒復(fù)制也得到了有效的抑制(圖3b)。上述結(jié)果表明兩株MAbs可以對小鼠感染EA H1N1病毒提供完全保護，同時對含有EA H1N1HA基因的重配型H1N1病毒也具有一定的抗感染免疫作用。

a.病毒感染小鼠的體重變化；b.病毒感染小鼠臟器病毒含量的測定a. Weight changes of the infected mice; b. Viral titers in the organs of the infected mice圖3 MAbs對病毒感染小鼠的免疫保護效果Fig.3 Protection induced by MAbs in mice against infection with HN11 and GD306 viruses

3 討 論

豬被稱為流感病毒的“混合器”，其呼吸道上皮細(xì)胞含有唾液酸α-2,3半乳糖苷(SA-α-2,3-Gal)受體和唾液酸α-2,6半乳糖苷(SA-α-2,6-Gal)受體，在病毒種間傳播和新型流感病毒的產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。近年來，EA H1N1 SIV在豬群中廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)及人的生命健康構(gòu)成了潛在威脅[7]。本研究選取一株EA H1N1 SIV作為免疫原，制備了兩株針對病毒HA蛋白的MAbs，命名為2B6和4C7。進(jìn)一步研究結(jié)果表明兩株MAbs腹水效價較高，可特異性地識別病毒的HA蛋白，具有HI活性和病毒中和活性，可對小鼠提供抗同源EA H1N1病毒感染的高效預(yù)防，同時對含有EAHA基因來源的重配型病毒也具有一定的抗感染免疫效果。

本研究中，關(guān)于MAbs的抗原結(jié)合活性的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株MAbs均不能在Western blot試驗中與全病毒的HA蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，可能是因為病毒蛋白樣品在裂解過程中導(dǎo)致其抗原的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致抗體無法識別。進(jìn)一步通過對病毒HA蛋白采用真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行表達(dá)，利用IFA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株MAbs均能夠與蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。提示本研究所制備的這兩株MAbs可以識別接近天然活性的病毒HA蛋白，而對于經(jīng)變性處理后的蛋白無法識別，由此推測此類抗體所針對的病毒抗原表位可能為構(gòu)象表位。

近年來，中和性MAbs在流感病毒研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，一方面是研究此類抗體作為流感的抗病毒藥物用以探討抗體治療的療效與機制，另一方面是分析確定MAbs特異性抗原結(jié)合表位，為新型疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。研究表明針對流感病毒(H2N2)的一株中和性MAb C179，可以同時中和H1、H2、H5、H6、H9亞型的流感病毒的感染[15-16]。本研究結(jié)果表明2B6和4C7這兩株MAbs的中和活性表現(xiàn)于對EA H1N1和攜帶有EA H1N1HA基因的重配型H1N1病毒。鑒于HN11為實驗室2005年分離的EA H1N1病毒，通過對兩株MAbs與2011—2015年期間分離毒株反應(yīng)情況的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著EA H1N1 病毒在豬群中的流行與傳播，病毒漸漸出現(xiàn)了抗原性的變化，即便是單純的EA H1N1病毒，其抗原性的變化已經(jīng)體現(xiàn)在抗體對病毒中和活性的差異，尤其是近年來豬群中又頻頻出現(xiàn)EA H1N1與2009/H1N1、經(jīng)典型H1N1等地方性流行毒株之間發(fā)生基因重配而產(chǎn)生了多重重配型的病毒，給SI疫苗研發(fā)帶來了更多的挑戰(zhàn)。作為一種理想的疫苗種毒毒株，在選擇上必須與流行毒株具有高度的抗原匹配性。由此，針對病毒諸如上述情況的出現(xiàn)，提示人們需要及時全面地掌握SIV流行毒株分子流行病學(xué)及其抗原性變異的情況，才能更好地防控SI。

4 結(jié) 論

利用EA H1N1 SIV全病毒蛋白作為免疫原，制備的兩株MAbs具有較高的病毒中和活性，可有效保護小鼠抵抗同源及異源H1N1 SIV的感染，MAbs能夠特異性識別病毒的HA蛋白。研究結(jié)果為進(jìn)一步將中和性MAb應(yīng)用于抗EA H1N1 SIV的感染及開展病原抗原性變異的分子基礎(chǔ)研究奠定了重要的工作基礎(chǔ)。