張會(huì)永，吳井生，李國(guó)輝，俞 燕，楊劍波，蘇一軍，殷建玫，韓 威*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125；2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，句容 212400)

禽白血病(avian leukosis，AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian leukosis/sarcoma virus，ALV)引起的禽類(主要是雞)各種良性和惡性腫瘤的一類疾病。禽白血病病毒依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原差異、病毒干擾試驗(yàn)、宿主范圍和基因組分子生物學(xué)特性將其劃分為10個(gè)亞群(A～J亞群)[1-2]和新發(fā)現(xiàn)的K亞群[3]，其中A、B、C、D、J亞群屬于外源性病毒，對(duì)雞生產(chǎn)影響較為嚴(yán)重的是A、B和J亞群[4-6]。

ALV可水平和垂直傳播[7-8]。水平傳播主要通過(guò)出雛和育雛期羽毛、糞便等接觸傳播，整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中疫苗免疫也是主要傳播途徑之一。已有的研究表明，ALV可通過(guò)母雞和公雞進(jìn)行垂直傳播，但是，公雞、母雞在ALV垂直傳播給下一代所起到的作用至今沒有相關(guān)報(bào)道。Tsukamoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)ALV可通過(guò)母雞輸卵管傳播給胚胎，Payne和Nair[10]報(bào)道也表明ALV-A、ALV-B和ALV-J均可通過(guò)母雞垂直傳播給后代。Segura等[11]、Smith和Fadly[12]研究認(rèn)為禽白血病病毒不能在公雞的生殖器官中增殖，公雞僅作為病毒載體，在交配過(guò)程中傳播給后代。張培培[13]在仿土蛋雞群J亞型禽白血病病毒的感染狀態(tài)評(píng)估及其來(lái)源探究中發(fā)現(xiàn)，后代分離到的ALV-J毒株與其父本ALV-J分離株的gp85基因序列相似性達(dá)98.5%～99.7%，表明其來(lái)源于父本。俞燕等[14-16]在地方雞種公雞精液檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)有ALV，Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)公雞可通過(guò)精液將ALV垂直傳播給后代。

針對(duì)雞遺傳資源保種場(chǎng)、基因庫(kù)而言，由于單個(gè)保種群規(guī)模較小(一般30～40個(gè)家系，搶救性保護(hù)群體數(shù)量更少)，若淘汰全部帶毒個(gè)體或家系(尤其是數(shù)量較少的公雞)，會(huì)導(dǎo)致群體規(guī)模驟減，造成遺傳多樣性丟失和近交系數(shù)過(guò)快增加?；诖?，我們以惠陽(yáng)胡須雞和汶上蘆花雞為素材，對(duì)陽(yáng)性公、母雞垂直傳播特性進(jìn)一步驗(yàn)證探討，旨在為優(yōu)化種禽場(chǎng)、保種場(chǎng)禽白血病凈化方案提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

惠陽(yáng)胡須雞和汶上蘆花雞均來(lái)源于國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)(江蘇)，43周齡時(shí)進(jìn)行禽白血病血液和精液病毒分離檢測(cè)，篩選個(gè)體組建以下試驗(yàn)組：(1)陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞♂×陰性汶上蘆花雞♀(♂3只，血液病毒分離S/P值分別為0.877、1.856、4.328；♀分3小 組，每組8只)；(2)血液和精液病毒分離檢測(cè)均為陰性的汶上蘆花雞♂×陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞(♂為3只，♀為3小組，S/P值分別在0.2～1、1～2、>2，每組8只)；(3)對(duì)照組，陰性蘆花公雞♂×陰性汶上蘆花雞♀(8只)，具體見表1。實(shí)驗(yàn)雞群人工輸精，每個(gè)母雞個(gè)體單獨(dú)一個(gè)輸精槍頭，收集種蛋12 d。種蛋標(biāo)記，孵化盒分裝孵化，雛雞隔離飼養(yǎng)。

1.2 樣品采集與處理

43周齡采集惠陽(yáng)胡須雞和汶上蘆花雞無(wú)菌抗凝血1.5 mL，并同時(shí)采集精液。對(duì)試驗(yàn)組后代采集1日齡胎糞，42日齡泄殖腔拭子、無(wú)菌抗凝血血液，死亡實(shí)驗(yàn)雞群的肝組織。胎糞和泄殖腔拭子：檢測(cè)前反復(fù)凍融3次，靜置取上清。血液、精液和肝組織處理及其病毒分離見參考文獻(xiàn)[14，18-19]。

表1實(shí)驗(yàn)公母雞分組情況

Table1Groupingsituationofroostersandhens

組別Groups公雞RoostersS/P值S/P value母雞HensS/P值S/P value陽(yáng)性♂×陰性♀A陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞0.877×陰性蘆花雞8只—B陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞1.856×陰性蘆花雞8只—C陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞4.328×陰性蘆花雞8只—陰性♂×陽(yáng)性♀D陰性蘆花雞—×陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞8只0.2～1E陰性蘆花雞—×陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞8只1～2F陰性蘆花雞—×陽(yáng)性惠陽(yáng)胡須雞8只>2陰性♂×陰性♀G陰性蘆花雞—×陰性蘆花雞8只—

1.3 p27抗原ELISA檢測(cè)

血漿病毒分離細(xì)胞上清，“1.2”中收取的毒液，凍融后的胎糞與泄殖腔拭子上清，用ALV p27抗原試劑盒檢測(cè)，具體操作按照IDEXX公司ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 前病毒cDNA的制備

根據(jù)病毒分離ELISA檢測(cè)結(jié)果，收取陽(yáng)性的DF-1細(xì)胞沉淀，按 OMEGA 公司 SQTISSUE組織 DNA 試劑盒說(shuō)明書制備前病毒基因組cDNA，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離株env基因的PCR擴(kuò)增和序列分析

針對(duì)env基因設(shè)計(jì)并合成一對(duì)通用引物，用于擴(kuò)增ALV囊膜蛋白env基因約2.6 kb片段(上游引物5′-CGAGAGTGGCTCGCGAGATGG-3′；下游引物5′-ACACTACATTTCCCCCTCCCTAT-3′)。以前病毒基因cDNA為模板，PCR擴(kuò)增ALV囊膜蛋白env基因，片段大小約2.6 kb。陰性對(duì)照為DF-1細(xì)胞DNA，陽(yáng)性對(duì)照為ALV-J NX0101株。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用TaKaRa公司DL5000 Marker，產(chǎn)物回收、純化后擴(kuò)增克隆至pMD18-T載體中測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS16.0t檢驗(yàn)對(duì)p27抗原陽(yáng)性率進(jìn)行比較分析，采用Blast和MEGA4.0程序進(jìn)行序列比對(duì)和聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性公、母雞后代ALV檢測(cè)結(jié)果

后代ALV檢測(cè)結(jié)果(表2)表明，陽(yáng)性公雞后代的胎糞p27抗原陽(yáng)性率為23.49%，42日齡泄殖腔拭子p27抗原陽(yáng)性率為36.60%，42日齡病毒分離陽(yáng)性率為8.54%；陽(yáng)性母雞后代的胎糞p27抗原陽(yáng)性率為12.42%，42日齡泄殖腔拭子p27抗原陽(yáng)性率為19.89%，42日齡病毒分離陽(yáng)性率為0%；陽(yáng)性公雞后代的胎糞、泄殖腔拭子和病毒分離陽(yáng)性率顯著高于陽(yáng)性母雞后代。

2.2 病毒分離檢測(cè)陽(yáng)性雞S/P值高低與后代ALV檢測(cè)陽(yáng)性率的相關(guān)性

病毒分離檢測(cè)S/P值高低與后代ALV檢測(cè)陽(yáng)性率的相關(guān)性分析結(jié)果(表3)表明，輸精個(gè)體S/P值的高低與后代陽(yáng)性率無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

2.3 胎糞、泄殖腔拭子與病毒分離p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性率比較

對(duì)胎糞、泄殖腔拭子與病毒分離p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)公雞為陽(yáng)性時(shí)，在后代胎糞檢測(cè)為陰性群體中，病毒分離檢測(cè)卻檢測(cè)到3個(gè)陽(yáng)性個(gè)體，胎糞檢測(cè)陽(yáng)性個(gè)體與病毒分離檢測(cè)陽(yáng)性個(gè)體的符合率為85%。說(shuō)明胎糞檢測(cè)有一定的漏檢率。42日齡棉拭子檢測(cè)的陽(yáng)性個(gè)體與病毒分離陽(yáng)性個(gè)體的陽(yáng)性符合率為100%。

2.4 病毒分離陽(yáng)性個(gè)體env基因的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

ALVenv基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小在2 600 bp左右，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.5 分離株env基因核苷酸序列分析

利用Blast對(duì)分離株env的gp85基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果表明，測(cè)序序列與已報(bào)道的ALV-J亞型序列(登錄號(hào)AF247385.1、KF796647.1、KT598484.1、GU222401.1、KT598483.1、JX855935.1)相似性>95%。該分離株的gp85序列與A、B、J亞型參考株的gp85基因序列進(jìn)行遺傳演化分析，如圖2中顯示，該序列與J亞型聚在同一分支，進(jìn)一步證明該毒株為J亞型。

表2陽(yáng)性公、母雞后代p27抗原檢測(cè)

Table2p27antigendetectionresultofALV-positiveroostersandhens

指標(biāo) Index陽(yáng)性公雞后代Offsprings of ALV-positive roosters陽(yáng)性母雞后代Offsprings of ALV-positive hens組別Group陽(yáng)性率/% Positive rate組別Groups陽(yáng)性率/%Positive rate胎糞p27抗原A22.50(18/80)D12.50(8/64)p27 antigen from meconiumB21.05(16/76)E12.70(8/63)C26.92(21/78)F12.07(7/58)x23.49±0.03*x12.42±0.00泄殖腔拭子p27抗原A36.36(28/77)D19.05(12/63)p27 antigen from cloacal swabsB34.25(25/73)E20.97(13/62)C39.19(29/74)F19.64(11/56)x36.60±0.01*x19.89±0.01病毒分離p27抗原A8.75(7/80)D0(0/63)p27 antigen from plasmaB7.89(6/76)E0(0/63)C8.97(7/78)F0(0/58)x8.54±0.01*x0

陽(yáng)性公雞后代與陽(yáng)性母雞后代相比，*.P<0.05(t檢驗(yàn))

Compared with offsprings of ALV-positive hens, *.P<0.05 (ttest)

表3陽(yáng)性公、母雞43周齡病毒分離S/P值與其后代ALV陽(yáng)性率的相關(guān)性分析

Table3CorrelationanalysisofamountofALVcarriedorshedbyALV-positiveroostersandhensandpositiverateofp27antigenintheiroffsprings

動(dòng)物及相關(guān)性分析Animal and correlation analysisS/P值S/P value胎糞p27抗原陽(yáng)性率/%Positive rate of p27 antigen from meconium泄殖腔拭子p27抗原陽(yáng)性率/%Positive rate of p27 antigen from cloacal swabs病毒分離p27抗原陽(yáng)性率/%Positive rate of p27 antigen from plasm陽(yáng)性公雞0.87722.50(18/80)36.36(28/77)8.75(7/80)Positive roosters1.85621.05(16/76)34.25(25/73)7.89(6/76)4.32826.92(21/78)39.19(29/74)8.97(7/78)相關(guān)性分析 Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05陽(yáng)性母雞0.2～112.50(8/64)19.05(12/63)0(0/63)Positive hen1～212.70(8/63)20.97(13/62)0(0/63)>212.07(7/58)19.64(11/56)0(0/58)相關(guān)性分析Correlation analysisP>0.05P>0.05P>0.05

3 討 論

3.1 試驗(yàn)組個(gè)體與檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的選擇

本試驗(yàn)開展的前提基礎(chǔ)是能準(zhǔn)確篩選出陽(yáng)性雞個(gè)體和陰性雞個(gè)體。根據(jù)發(fā)病雞的表型和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可準(zhǔn)確檢測(cè)出禽白血病陽(yáng)性個(gè)體，但是陰性個(gè)體確定十分困難。為確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，惠陽(yáng)胡須雞陽(yáng)性個(gè)體確定是通過(guò)43周齡血液病毒分離檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，結(jié)合試驗(yàn)后期病癥解剖觀測(cè)；汶上蘆花雞陰性個(gè)體是通過(guò)43周齡血液病毒陰性結(jié)果，結(jié)合家系病史追溯，要求篩選出的陰性個(gè)體上3個(gè)世代家系內(nèi)沒有出現(xiàn)禽白血病個(gè)體。

在前期工作中對(duì)地方雞種進(jìn)行了排毒規(guī)律摸索，發(fā)現(xiàn)5周齡排毒量最高[18]，結(jié)合生產(chǎn)的需要(6周齡進(jìn)行篩選雞群進(jìn)行轉(zhuǎn)群)，試驗(yàn)確定在6周齡對(duì)試驗(yàn)組后代個(gè)體進(jìn)行禽白血病病毒分離檢測(cè)。通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序和遺傳聚類分析，確定本試驗(yàn)個(gè)體感染毒株為J亞型禽白血病病毒。

3.2 ALV通過(guò)陽(yáng)性公雞(母雞)傳播后代的規(guī)律

趙鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)種蛋中禽白血病病毒p27抗原檢出率與雞群禽白血病發(fā)病率呈正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了ALV可通過(guò)公雞精液傳播給后代，且公雞在ALV傳播給后代過(guò)程中起重要作用。

M. DL5000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5. ALV env基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DL5000 marker；1-5. Amplification products of ALV env圖1 ALV env基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ALV env

△.本研究分離毒株序列；○.ALV-B gp85基因序列；□.ALV-A gp85基因序列△.Sequence of isolated strain in this study；○.gp85 gene sequence of ALV-B；□. gp85 gene sequence of ALV-A圖2 不同亞型禽白血病毒株gp85基因序列的遺傳演化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of gp85 gene sequence of avian leukosis viruses strains subtype A，B and J

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)禽白血病陽(yáng)性公雞后代病毒分離的陽(yáng)性率為8.54%，禽白血病陽(yáng)性母雞后代沒有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體；且陽(yáng)性公雞后代的胎糞p27抗原、泄殖腔拭子p27抗原與血液病毒分離陽(yáng)性率顯著高于陽(yáng)性母雞后代。該研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了張培培等[13，17]的研究結(jié)果，更進(jìn)一步得出了陽(yáng)性公雞對(duì)ALV的垂直傳播影響較大的結(jié)論。對(duì)于在陽(yáng)性母雞后代中沒有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性個(gè)體，分析主要有幾方面原因：一是品種原因，不同品種對(duì)ALV的易感性不同；且本試驗(yàn)是雜交試驗(yàn)，有可能增強(qiáng)了雞的抵抗力；二是本試驗(yàn)并非SPF雞，雞本身存在抗體；三是采取了母雞單個(gè)輸精槍頭；四是可能與檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)有關(guān)；課題組對(duì)試驗(yàn)雞群將繼續(xù)飼養(yǎng)檢測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

試驗(yàn)結(jié)果提示在禽白血病凈化過(guò)程中，應(yīng)加大對(duì)公雞的檢測(cè)力度，建議采取血液病毒分離和精液病毒分離相結(jié)合的方法[17]。

3.3 陽(yáng)性雞S/P值大小對(duì)后代陽(yáng)性率影響

本試驗(yàn)禽白血病檢測(cè)使用的ELISA試劑盒，其陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為S/P>0.2。S/P值高低與后代陽(yáng)性率是否存現(xiàn)相關(guān)性，相關(guān)報(bào)道較少。郝建勇等[15]研究表明，在蛋清ELISA檢測(cè)時(shí)，S/P值高低與對(duì)應(yīng)母雞外源性ALV病毒血癥有一定的相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)43周齡血液病毒分離檢測(cè)為陽(yáng)性個(gè)體的S/P值高低與后代的陽(yáng)性率沒有顯著的相關(guān)性。

3.4 不同檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較

針對(duì)胎糞、泄殖腔拭子的假陽(yáng)性和漏檢等研究報(bào)道很多，陳俊霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，胎糞p27抗原檢測(cè)和泄殖腔拭子p27抗原檢測(cè)均有較高的假陽(yáng)性，并且有一定的漏檢。俞燕等[18]也發(fā)現(xiàn)泄殖腔拭子有較高的假陽(yáng)性，且有漏檢。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胎糞p27抗原與泄殖腔棉拭子p27抗原檢測(cè)存在較高的假陽(yáng)性，尤其是泄殖腔棉拭子p27抗原檢測(cè)假陽(yáng)性較高。在胎糞p27抗原檢測(cè)陰性個(gè)體中，血液病毒分離p27抗原檢測(cè)出現(xiàn)了3個(gè)陽(yáng)性個(gè)體，胎糞檢測(cè)漏檢率為15%。42日齡泄殖腔拭子p27抗原檢測(cè)結(jié)果與病毒分離檢測(cè)符合率為100%。對(duì)禽白血病進(jìn)行凈化，一般情況下，前期檢測(cè)(胎糞、42日齡血液病毒分離)采取的是家系淘汰法，即一個(gè)個(gè)體為陽(yáng)性，家系后代全部淘汰，增加了凈化工作量和成本。因此建議不進(jìn)行胎糞及泄殖腔拭子ALV檢測(cè)。

在AL的防控中，除了對(duì)種群進(jìn)行ALV檢測(cè)及時(shí)淘汰陽(yáng)性個(gè)體，還應(yīng)制定嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理措施。孵化、育雛、疫苗免疫、輸精等是影響禽白血病水平傳播的重要途徑，生產(chǎn)中對(duì)新疫苗及時(shí)進(jìn)行禽白血病檢測(cè)，疫苗注射在不同品種間換針頭，多品種一起繼代繁殖時(shí)，每個(gè)品種(家系)使用固定的輸精杯，陽(yáng)性率高、低品種分開孵化出雛。

4 結(jié) 論

在地方品種惠陽(yáng)胡須雞和汶上蘆花雞中，ALV陽(yáng)性公雞后代的陽(yáng)性率顯著高于陽(yáng)性母雞后代，血液病毒分離檢測(cè)陽(yáng)性雞S/P值高低與后代陽(yáng)性率沒有顯著相關(guān)性，ALV胎糞檢測(cè)和泄殖腔棉拭子具有較高的假陽(yáng)性率。研究結(jié)果為進(jìn)一步制定更合理的禽白血病凈化方案提供了理論依據(jù)。