胡慧艷，賈 青,2,3*，侯勝奎，劉 津，張 婧，張偉峰，錫建中

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，保定 071000； 2.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，保定 071000；3.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，保定 071000； 4.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056038)

繁殖力對母豬來說是一個至關(guān)重要的經(jīng)濟因素，因而提高豬繁殖力是養(yǎng)豬業(yè)需要解決的關(guān)鍵性問題。眾多研究顯示，類固醇激素合成能力的強弱是影響繁殖力的一個重要因素[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，類固醇合成的快速調(diào)節(jié)機制對于調(diào)節(jié)動物的生殖活動必不可少，卵泡發(fā)育與類固醇激素的合成與分泌密切相關(guān)。類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)作為膽固醇由線粒體外膜向內(nèi)膜轉(zhuǎn)運的橋梁，參與了類固醇激素的合成，該蛋白由StAR基因所編碼。在雌性動物卵巢中，排卵、卵泡的生長與閉鎖，以及成熟卵泡內(nèi)細胞的分化等一系列生理過程均受到類固醇激素的調(diào)控。相關(guān)研究顯示，排卵前卵泡分泌的主要類固醇激素是雌激素，在排卵后，低密度脂蛋白通過上調(diào)類固醇合成關(guān)鍵基因StAR和P450的表達量來調(diào)控其孕酮合成水平[2]，并促使卵泡由分泌雌激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅糠置谠型猍1, 3]，若降低StAR基因的表達水平則可致使卵巢孕酮合成水平下降，此時配種后受胎率明顯下降，可見在哺乳動物中，StAR基因是調(diào)控類固醇激素合成的一個關(guān)鍵因素，然而該基因的表達也受到多種因素的影響，如胰島素、LH、FSH等激素[4-6]和IGF1、TGF-β多種生長因子[7]以及轉(zhuǎn)錄因子[8]等多種方式。此外，在表觀遺傳修飾方面相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠顆粒細胞向黃體細胞分化過程中StAR基因啟動子區(qū)會發(fā)生組蛋白修飾[9-10]；很多轉(zhuǎn)錄因子如cAMP response element-binding protein (CREB)、GATA4、CCAAT/enhancer binding proteins(C/EBPs)參與了大鼠StAR啟動子的調(diào)控[11-12]。然而，豬StAR基因的調(diào)控機制目前尚未見報道。

為了解豬StAR基因表達的調(diào)控機制，本研究分析了豬StAR基因5′非翻譯區(qū)和啟動子區(qū)，測定StAR基因的5′側(cè)翼區(qū)序列的轉(zhuǎn)錄活性，篩選出該基因啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，探索其可能的調(diào)控機制，為進一步揭示豬StAR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎上皮細胞系(293T)由本實驗室保存；pGL3-Basic、pRL-TK 載體、T4DNA Ligase、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自Promega公司；TailGen DNA Kit購自康為世紀公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep 柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根公司； 轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自 IVGN公司；限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ均購自TaKaRa公司；Trans5α 感受態(tài)細胞、Trans Taq-T DNA 聚合酶、TransSerumTM HQ Fetal Bovine Serum等均購自于北京TransGen生物技術(shù)有限公司；Hyclone DMEM/ HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購自Thermo公司；DL5000 DNA Marker購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；0.25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)、Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；引物合成和測序均由北京華大科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 豬StAR基因5′側(cè)翼區(qū)序列分析及引物設(shè)計 檢索并下載豬StAR基因(Ensembl數(shù)據(jù)庫：ENSSSCG00000034942)的參考序列，通過基因啟動子在線預(yù)測分析軟件MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預(yù)測CpG島；通過在線軟件：AliBaba2.1 (http://www.gene-regulation.com/pub/ programs.html)、JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.binf.ku.dk/)預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。根據(jù)pGL3-Basic質(zhì)粒的多克隆位點信息，以StAR基因5′ UTR上游序列約2 000 bp為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增包含StAR基因啟動子區(qū)片段的特異引物，分別在上、下游引物5′端引入限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點及其對應(yīng)的保護堿基，構(gòu)建載體片段的引物序列詳見表1。

表1本研究所用引物信息

Table1Theinformationsofprimerusedinthisstudy

引物編號(位置/bp)Primers No.(position)引物序列(5'→3')Primer sequence退火溫度/℃Annealing temperature片段長度/bpFragments sizepGL3-1 (-1 939/-103)F: GGGGTACCTGTTACAATACTGATGGACCTG651 837R: CCCAAGCTTGCCAAGGATAGAGGGATTpGL3-2 (-1 311/-103)F: GGGGTACCGAGCCGTGAGTTTGTCT651 209R: CCCAAGCTTGCCAAGGATAGAGGGATTpGL3-3 (-470/-103)F: GGGGTACCCAGATTCAAGCCGCAGTC65377R: CCCAAGCTTGCCAAGGATAGAGGGATTpGL3-4 (-196/-103)F: GGGGTACCAGCCTCCTTACTCCTTTCTA6594R: CCCAAGCTTGCCAAGGATAGAGGGATTpGL3-5 (-1 939/+127)F: GGGGTACCTGTTACAATACTGATGGACCTG652 066R: CCCAAGCTTGGAGCATTGTTTCCTGGTAGpGL3-6 (-1 311/+127)F: GGGGTACCGAGCCGTGAGTTTGTCTT651 438R: CCCAAGCTTGGAGCATTGTTTCCTGGTAGpGL3-7 (-470/+127)F: GGGGTACCCAGATTCAAGCCGCAGTC65597R: CCCAAGCTTGGAGCATTGTTTCCTGGTAGpGL3-8 (-196/+127)F: GGGGTACCAGCCTCCTTACTCCTTTCTA65323R: CCCAAGCTTGGAGCATTGTTTCCTGGTAGpGL3-9 (-41/+127)F: GGGGTACCCTGGAGGCATTTAAGACG64168R: CCCAAGCTTGGAGCATTGTTTCCTGGTAGpGL3-10 (-120/-17)F: GGGGTACCAATCCCTCTATCCTTGGC64104R: CCCAAGCTTTCTTGCGTCTTAAATGCC

下劃線表示限制性內(nèi)切酶的酶切位點

The restriction enzyme digestion sites are underlined

1.2.2 豬StAR基因5′側(cè)翼區(qū)的克隆 提取大白豬耳組織基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用PCR方法，利用表1中引物擴增豬StAR基因啟動子區(qū)片段，PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，Trans Taq-T DNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.7 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL，上、下游引物(10 pmol·μL-1) 各1.0 μL，各模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至25.0 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。StAR-1～StAR-4為首次缺失片段，StAR-5～StAR-10為二次缺失片段。

1.2.3 pGL3-StAR啟動子不同長度片段重組載體的構(gòu)建 將測序正確的上述10個PCR產(chǎn)物及其pGL3-Basic質(zhì)粒分別利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切，凝膠回收酶切產(chǎn)物后，采用T4連接酶分別將10個片段與pGL3-Basic連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR鑒定，陽性克隆者測序，并進行質(zhì)粒雙酶切，分別命名為pGL3-1939/-103、pGL3-1311/-103、pGL3-470/-103、pGL3-196/-103、pGL3-1939/+127、pGL3-1311/+127、pGL3-470/+127、pGL3-196/+127、pGL3-41/+127、pGL3-120/-17。

1.2.4 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及活性檢測 將293T細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的細胞接種于不含抗生素的24孔板中，待細胞融合度達80%～90%時，分別將重組報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK與轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000加入至Opti-MEM培養(yǎng)基中，并將其混合物轉(zhuǎn)染至293T細胞，培養(yǎng)48 h后裂解細胞，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，采用化學(xué)發(fā)光儀(Promega)測定熒光素酶活性，試驗重復(fù)3次及以上，每次3個平行。

1.2.5 統(tǒng)計分析 對各組試驗至少重復(fù)3次，利用單因素方差分析檢驗不同片段酶活性的差異性，Duncan′s檢驗法進行多重比較，數(shù)據(jù)均采用“平均值±標準差”表示。數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 StAR基因5′側(cè)翼區(qū)序列分析

利用啟動子分析軟件對豬StAR基因5′側(cè)翼區(qū)序列特征信號進行了分析，結(jié)果顯示，該序列不具有真核生物啟動子典型的TATA-box，此外在該啟動子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)可能存在GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16、ZNF740等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。一般認為CpG島大于100 bp，且GC含量大于50%[13]，本試驗利用MethPrimer軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，目的基因StAR啟動子不存在CpG 島(圖1)。

F1～F5. 亞硫酸鹽PCR上游引物；R1～R5. 亞硫酸鹽PCR下游引物F1-F5. Bisulfite PCR left primers; R1-R5. Bisulfite PCR right primers圖1 CpG島預(yù)測結(jié)果Fig.1 CpG island prediction results

2.2 豬StAR基因啟動子缺失片段的擴增

通過PCR擴增得到豬StAR基因啟動子5′端10個不同片段， PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖2所示，擴增出的不同長度片段與預(yù)期片段大小相一致(圖2)。

2.3 豬StAR基因啟動子不同長度片段重組表達載體的構(gòu)建

分別將StAR基因啟動子系列片段(pGL3-1～pGL3-10)和pGL3-Basic進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后構(gòu)建不同長度的StAR基因啟動子重組質(zhì)粒，經(jīng)菌液PCR鑒定，為陽性克隆者進行測序和質(zhì)粒雙酶切。重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果顯示，各重組質(zhì)粒均產(chǎn)生pGL3-Basic載體片段及各自相應(yīng)的片段(圖3)；測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中豬的StAR基因5′端序列相一致。因而，豬StAR基因啟動子缺失片段的熒光素酶報告基因載體構(gòu)建成功。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準;1～4. pGL3-1～pGL3-4不同長度擴增片段(A)；1～6. pGL3-5～pGL3-10不同長度擴增片段(B)M. DL5000 DNA marker; 1-4. Different length of amplified fragments of pGL3-1-pGL3-4(A); 1-6. Different length of amplified fragments of pGL3-5-pGL3-10(B)圖2 豬StAR基因啟動子不同長度片段PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electropherogram of PCR products of the fragments with different length in swine StAR promoter

M. DNA相對分子質(zhì)量標準;1～4. pGL3-1～pGL3-4片段酶切鑒定(A)；1～6. pGL3-5～pGL3-10片段酶切鑒定(B)M. DL5000 DNA marker; 1-4. Enzyme digestion of pGL3-1-pGL3-4 fragments(A); 1-6. Enzyme digestion of pGL3-5-pGL3-10 fragments(B)圖3 pGL3-StAR重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electropherogram of pGL3-StAR by enzyme digestion

2.4 豬StAR基因啟動子不同片段活性分析

將pEGFPN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞，轉(zhuǎn)染6 h后觀察細胞生長狀態(tài)良好，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率，如圖4所示，經(jīng)過計算超過70%以上的細胞中可以觀察到綠色熒光信號。以pGL3-Basic質(zhì)粒作為陰性對照，將上述所構(gòu)建的4個重組質(zhì)粒分別與pRL-TK共轉(zhuǎn)染至293T細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶和內(nèi)對照海腎熒光素酶熒光值，由圖5A可知，所構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-1939/-103、pGL3-1311/-103、pGL3-470/-103、pGL3-196/-103的熒光素酶活性與pGL3-Basic對照組相比均差異不顯著(P>0.05)，說明豬StAR基因-1939～-103 bp (以轉(zhuǎn)錄起始位點為+1)區(qū)域不具有轉(zhuǎn)錄活性。

進而構(gòu)建pGL3-1939/+127、pGL3-1311/+127、pGL3-470/+127、pGL3-196/+127并轉(zhuǎn)染293T細胞后檢測其熒光值，由圖5B可知，與先前構(gòu)建的4個片段重組質(zhì)粒相比，片段-1 311～+127、-470～ +127、-196～+127、-120～-17活性極顯著增加(P<0.01)，其中片段-196～+127 bp 活性值最高，且極顯著高于其他缺失片段(P<0.01)，表明-103～+127 bp 這一區(qū)域存在正調(diào)控元件。進一步將-196～+127截短為-41～+127，構(gòu)建pGL3-41/+127 重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細胞后檢測其熒光值，結(jié)果顯示，該區(qū)域不存在轉(zhuǎn)錄活性，說明-41～-196 bp存在正調(diào)控元件，進而構(gòu)建pGL3-120/-17重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，該區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄活性，進一步證明-41～-196 bp 這一區(qū)域存在著重要的正調(diào)控元件。

圖4 轉(zhuǎn)染后的293T細胞Fig.4 The 293T cells after transfection

各重組質(zhì)粒熒光素酶活性相比，相同小寫字母標注者為差異不顯著(P>0.05), 不同小寫字母標注者為差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母標注者為差異極顯著(P<0.01)Bars with the same small letter mean no significant difference (P>0.05), bars with the different small letters mean significant difference (P<0.05), bars with different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01) among different luciferase activity of recombinant vectors圖5 重組質(zhì)粒pGL3-StAR轉(zhuǎn)染293T細胞的活性分析Fig.5 Activity analysis of recombinant vectors pGL3-StAR in 293T cells

3 討 論

類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR) 位于相關(guān)細胞的線粒體膜上，且具有高度的組織特異性，參與類固醇激素的合成，調(diào)節(jié)膽固醇從線粒體外膜向線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運，是腎上腺皮質(zhì)和生殖腺類固醇生成細胞中合成類固醇激素所需的物質(zhì)[14]。StAR基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上受多種促激素和細胞因子的調(diào)控，進而影響著機體類固醇激素的合成[15-17]。在人類中，StAR基因突變可致使其蛋白失去功能，腎上腺和性腺類固醇合成受阻，從而引起一種常染色體隱性遺傳病即先天性脂樣腎功能增生綜合征；在小鼠上，StAR基因在腎上腺、睪丸、卵巢組織中特異性表達，缺失該基因的小鼠發(fā)育會受阻，壽命會縮短[18]。卵巢作為雌性動物重要的生殖器官，其功能主要是產(chǎn)生卵細胞以及分泌類固醇激素。研究者在極端高、低產(chǎn)仔數(shù)的約克夏母豬卵巢轉(zhuǎn)錄組測序中發(fā)現(xiàn)了StAR基因在高產(chǎn)組高表達的現(xiàn)象，經(jīng)篩選分析將該基因作為豬繁殖力和產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的候選基因[19]。在豬上，StAR基因的調(diào)控機制和信號通路尚未研究清楚。因此，本試驗對豬StAR啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性進行了研究。

基于生物信息學(xué)方法對豬StAR基因5′端序列進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬StAR基因5′端序列不存在典型的順式元件TATA-box，事實上TATA-box是構(gòu)成真核生物典型的核心啟動子元件之一，但TATA-box也并不總是存在于一個基本的啟動子區(qū)域[20]。為了研究StAR基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性及其調(diào)控機制，本試驗采用構(gòu)建啟動子缺失片段的方法[21-22]，通過構(gòu)建熒火蟲熒光素酶重組載體，轉(zhuǎn)染至293T細胞，利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對構(gòu)建的不同長度啟動子區(qū)片段進行活性檢測。結(jié)果顯示，豬StAR基因的啟動子區(qū)域-196～-127 bp活性值最高。采用JASPAR的在線程序MatInspector功能來預(yù)測潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，在豬StAR啟動子的-196 ～-41 bp區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子GATA4、GATA6、SF-1、SP1、ZNF263、ZNF740、ATF4的結(jié)合位點。研究報道表明，GATA4在類固醇生成、性別分化等方面具有重要的作用，GATA4和GATA6在腎上腺和性腺中高表達[23]。在哺乳動物卵巢組織中的作用主要是由cAMP通過PKA途徑增加GATA4 磷酸化水平，進而調(diào)節(jié)GATA依賴性靶基因的表達，如類固醇合成關(guān)鍵基因StAR和Cyp17等對卵泡發(fā)育有重要作用的靶基因[24]；研究還發(fā)現(xiàn)，StAR基因在豬發(fā)情周期的各個階段也均有表達[4]，該基因啟動子區(qū)GATA4結(jié)合區(qū)序列缺失會影響FSH誘導(dǎo)的StAR啟動子的活性[25-26]。做為GATA家族的另一成員，GATA6不僅可以調(diào)節(jié)心、肺組織中相關(guān)基因的表達，對組織的正常發(fā)育也起到了重要作用，而且在生殖腺中被認為是StAR基因的正向調(diào)控因子[27-28]。類固醇合成因子-1(SF-1) 與StAR基因之間的相互作用已通過體外試驗證明：在尼古丁處理的NCI-H295A細胞中，SF-1在StAR基因表達量降低時，類固醇合成水平也隨著降低[29]，可見轉(zhuǎn)錄因子SF-1也是激活StAR的潛在正調(diào)控因子。對于ZNF轉(zhuǎn)錄因子，目前在植物中只是作為順式作用元件在代謝物生物合成中起重要作用[30-31]；在動物中，基于ZNF與StAR基因的調(diào)控關(guān)系，將來可以直接采用電泳遷移率變動分析(EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀等方法來進一步研究ZNF的調(diào)節(jié)功能。

4 結(jié) 論

本試驗通過對StAR基因進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建豬StAR基因啟動子區(qū)不同長度片段的重組載體，并利用雙報告基因報告系統(tǒng)檢測其活性，證實了StAR基因的5′側(cè)翼區(qū)序列具有啟動子活性。初步確定了豬StAR基因的啟動子區(qū)域，找到了該基因啟動子的核心區(qū)域和主要調(diào)控區(qū)域，為進一步研究豬StAR基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供理論依據(jù)。