劉 璐，郭 杰，朱可蒙，王 寧，辛九慶，劉玉芬*，劉恒貴*

(1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動物支原體團(tuán)隊(duì)，哈爾濱 150069)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是一種廣泛流行的只感染豬的支原體，能夠引起豬慢性肺炎，導(dǎo)致體重增長緩慢和食物轉(zhuǎn)化率下降，對豬規(guī)?；曫B(yǎng)具有重要的影響[1]。Mhp引起豬支原體肺炎的第一步是特異性黏附到呼吸道黏膜上皮細(xì)胞表面，導(dǎo)致纖毛擺動停滯、脫落和上皮細(xì)胞破損，然后激發(fā)宿主炎癥反應(yīng)，使豬易于繼發(fā)其他病原體的感染。Mhp對纖毛上皮細(xì)胞的黏附是引發(fā)感染的先決條件。張啟敬等[2]首次利用制備的單克隆抗體F1B6和F2G5發(fā)現(xiàn)了Mhp的膜蛋白P97，他們進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些單抗結(jié)合P97后，豬肺炎支原體就失去了對纖毛的黏附能力，因此，P97是Mhp膜上的一種黏附蛋白，并且在支原體感染過程中發(fā)揮著重要的功能。有研究表明，P97是豬肺炎支原體最主要的抗原蛋白之一，它在Mhp感染時(shí)引發(fā)的免疫反應(yīng)要早于其他抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgA和IgM抗體比其他抗原的抗體要早35～60 d[3]，并證實(shí)纖毛和阻斷黏附抗體的結(jié)合位點(diǎn)位于P97 C端的重復(fù)序列[4-5]。近些年，有許多研究者對P97或其R1區(qū)進(jìn)行了表達(dá)，驗(yàn)證了其具有良好的免疫原性[6]。

B細(xì)胞表位是位于蛋白質(zhì)抗原上的抗體識別的最小多肽序列，目前，已有大量利用P97的免疫原性特點(diǎn)在疫苗及診斷方面的研究報(bào)道[7-13]，然而，對該蛋白上B細(xì)胞表位的探索卻幾乎是一片空白。本研究擬構(gòu)建P97蛋白抗原的酵母隨機(jī)展示文庫，并篩選、鑒定特異性B細(xì)胞表位。該文庫的構(gòu)建和特異性B細(xì)胞表位的鑒定將為我們進(jìn)一步研制開發(fā)基于抗原表位水平的Mhp特異性診斷試劑盒和疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、工具酶、試劑、抗體和引物

E.coliDH5α購自益生科技；酵母菌株EBY-100、酵母表達(dá)載體pCT-XcmⅠ由本實(shí)驗(yàn)室保存，pMD18-T載體購自TaKaRa公司。ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；DNaseⅠ購自NEB公司；雞源抗C-Myc抗體、FITC標(biāo)記兔抗雞IgY購自life Technologies公司；山梨醇(sorbitol)、醋酸鋰(LiAc)購自Sigma公司；蛋白胨、Yeast nitroen base、Casamino acids、D-葡萄糖購自美國BD公司；Tris-HCl、MnCl2、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、瓊脂粉、氯化鈉(NaCl)、磷酸氫 二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 p97基因的擴(kuò)增與突變

以Mhp全基因組為模板用p97-F和p97-R引物PCR擴(kuò)增p97基因。針對p97基因上TGA的位點(diǎn)設(shè)計(jì)三對突變引物，分別為p97-mut-F1/R1、p97-mut-F2/R2和p97-mut-F3/R3(如表1)，運(yùn)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)將p97基因上三個(gè)TGA位點(diǎn)依次突變?yōu)門GG，膠回收純化突變的產(chǎn)物，通過測序方法鑒定突變后p97基因的正確性。

1.3 酵母感受態(tài)的制備

將釀酒酵母EBY100菌接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基(20 g·L-1蛋白胨，10 g·L-1酵母提取物)在30 ℃和220 r·min-1搖床中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)的酵母細(xì)胞液按1∶100轉(zhuǎn)接于500 mL新的YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6～0.8。在室溫條件下1 500 g離心5 min，收集酵母細(xì)胞，加入25 mL緩沖溶液Ⅰ(0.6 mol·L-1sorbitol，100 mmol·L-1LiAc, 10 mmol·L-1Tris-Cl, pH=7.5, 10 mmol·L-1DTT),在30 ℃，220 r·min-1培養(yǎng)30 min。于4 ℃和1 500 g條件下離心收集酵母細(xì)胞，然后用50 mL預(yù)冷的1 mol·L-1山梨醇溶液洗滌酵母細(xì)胞2次。獲得的酵母細(xì)胞感受態(tài)用1 mL 的1 mol·L-1山梨醇溶液重懸，分裝后放置于-80 ℃保存。

表1引物序列

Table1Primersequences

引物名稱Primer name序列Sequencesp97-mut-F15'-TGGCTAGTTGATTCTAATAACAAT-3'p97-mut-R15'-CCTTTTGACTATTTTATAATCAG-3'p97-mut-F25'-TGGACAGGAAAAATTCAGCATCCTG-3'p97-mut-R25'-GGAATTAAGCACGGATTTAAAG-3'p97-mut-F35'-TGGGCAAAATTAGACGATAATCTTC-3'p97-mut-R35'-AGGAGCAAAATTATTAAATTGGG-3'p97-F5'-ATGAGTAAAAAATCAAAAACATTTAA-3'p97-R5'-TTATTTAGATTTTAATTCCTGATTAT-3'

1.4 P97酵母隨機(jī)展示文庫的構(gòu)建與質(zhì)量鑒定

首先，利用DNase Ⅰ 和相應(yīng)緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl pH=7.5；5 mmol·L-1MnCl2)在37 ℃下對p97突變基因片段進(jìn)行隨機(jī)酶切，酶切反應(yīng)用0.5 mol·L-1的EDTA終止。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后用ExTaqDNA聚合酶末端加A處理。處理后的突變p97隨機(jī)酶切片段與用XcmⅠ處理回收的pCT-Xcm Ⅰ 按3∶1混合，混合物通過T4 DNA連接酶在16 ℃下過夜連接。連接產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化后電擊轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)中。取少量電轉(zhuǎn)化后的酵母涂布于SDCAA(6.7 g Yeast nitrogen base，5 g Casamino acids，13.6 g Na2HPO4·12H2O，8.56 g NaH2PO4·H2O，20 g dextrose，加入1 L ddH2O)固體培養(yǎng)基計(jì)算酵母文庫的庫容量。其余酵母細(xì)胞液在1 500 g條件下離心5 min后棄上清，加入50 mL SDCAA選擇液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。文庫上插入的片段質(zhì)量通過隨機(jī)挑取培養(yǎng)皿上酵母單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。

1. 5 P97酵母隨機(jī)展示文庫的誘導(dǎo)及分選

取10 mL SDCAA選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母文庫細(xì)胞，加入含2%半乳糖的SGCAA液體培養(yǎng)基，在30 ℃對酵母細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)48 h。然后，取約1×107個(gè)酵母細(xì)胞，用PBS洗2次。用200 μL PBS重懸酵母細(xì)胞，加入雞源抗C-Myc抗體，室溫孵育30 min，用PBS洗3次；再用200 μL PBS重懸酵母細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的兔抗雞IgY抗體，室溫孵育30 min，用PBS洗三次，最后用500 μL PBS重懸，用流式細(xì)胞儀分析鑒定酵母細(xì)胞的表達(dá)量。采用相同的方法，將P97酵母隨機(jī)展示文庫依次用Mhp天然感染的豬陽性血清和FITC標(biāo)記的抗豬IgG的二抗進(jìn)行染色，以只用二抗孵育的酵母文庫作為陰性對照。Mhp抗體標(biāo)記的酵母文庫通過流式細(xì)胞儀分選出結(jié)合能力較強(qiáng)的陽性酵母克隆，從陽性克隆中提取質(zhì)粒送測序。

2 結(jié) 果

2.1 p97基因擴(kuò)增與突變

以Mhp全基因組為模板，用PCR擴(kuò)增的方法獲得全長p97基因，PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增p97產(chǎn)物片段的大小在3 000 bp標(biāo)準(zhǔn)marker附近，與預(yù)期大小3 279 bp相符。由于在支原體中TGA終止密碼子編碼色氨酸，為了使p97上包含TGA密碼子的抗原肽能在酵母中展示表達(dá)，p97基因上的三個(gè)TGA終止密碼子用PCR定點(diǎn)突變的方法進(jìn)行了TGG突變，通過測序鑒定確定突變后的p97基因完全正確，并且基因內(nèi)部的TGA終止密碼子全部成功突變?yōu)門GG。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. p97基因的PCR產(chǎn)物M. DL5000 DNA marker；1. PCR products of p97 gene圖1 p97基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 Amplification of p97 gene by PCR

2.2 P97酵母隨機(jī)展示文庫的構(gòu)建及其質(zhì)量評價(jià)

利用DNaseⅠ對突變后的p97基因隨機(jī)酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，突變p97隨機(jī)酶切片段主要集中在100～250 bp之間，表明本試驗(yàn)成功將p97突變基因進(jìn)行了隨機(jī)消化。將突變p97的隨機(jī)片段與酵母載體的連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)，采用十倍梯度稀釋方法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，經(jīng)過涂板計(jì)數(shù)后，酵母表達(dá)文庫的庫容量約為2.86×106CFU，從中隨機(jī)挑取100個(gè)單克隆進(jìn)行測序分析，測序獲得的突變p97小片段與突變p97全長基因比對結(jié)果顯示，100個(gè)克隆中插入的突變p97隨機(jī)小片段覆蓋了整個(gè)p97突變基因，而且分布均勻，長度大部分集中在100～250 bp(圖3～4)。在這些片段中，正向插入的片段有53個(gè)，占挑取克隆數(shù)的53%；反向插入的有47個(gè)，占47%。

從以上數(shù)據(jù)可以看出該文庫的庫容量達(dá)到了用于抗原表位篩選的要求，而且片段隨機(jī)分布，豐度均勻，因此可以用于分析P97蛋白上的B細(xì)胞表位。

M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. p97突變基因經(jīng)DNaseⅠ隨機(jī)消化結(jié)果M. DL2000 marker；1. DNaseⅠ digested mutant p97 gene圖2 DNaseⅠ 隨機(jī)消化p97突變基因電泳圖Fig.2 Random digestion of mutant p97 with DNaseⅠ

圖3 酵母文庫隨機(jī)單克隆測序結(jié)果Fig.3 The sequencing result of randomly selected clones from yeast library

圖4 酵母隨機(jī)展示文庫中插入的突變p97隨機(jī)片段長度統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.4 The length statistics of random mutant p97 Nucleic acid fragment inserted in yeast library

2.3 P97酵母隨機(jī)展示文庫的誘導(dǎo)表達(dá)及陽性克隆的分選

為了進(jìn)一步驗(yàn)證酵母隨機(jī)展示文庫是否成功表達(dá)插入的P97抗原片段，將構(gòu)建的酵母文庫進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過雞源抗C-Myc抗體染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖5所示，文庫中約5%的酵母表面表達(dá)了P97的隨機(jī)抗原片段，這表明構(gòu)建的酵母隨機(jī)展示文庫含有相當(dāng)部分的有效插入P97隨機(jī)片段，能用于對Mhp感染過程中P97抗原表位的篩選。

利用Mhp天然感染的豬陽性血清對展示在酵母表面的抗原肽進(jìn)行流式分選，經(jīng)鑒定得到與血清反應(yīng)較強(qiáng)的184號酵母克隆(圖5)，為了驗(yàn)證該克隆中插入的184號抗原肽是否為最小的抗原表位，進(jìn)一步從184短肽C端逐個(gè)缺失1、2、4、5、6個(gè)氨基酸后(表2)，再次將其展示到酵母細(xì)胞表面，用Mhp天然感染的豬陽性血清對其進(jìn)行流式分析。如圖6所示，184號短肽缺失氨基酸后，與抗體結(jié)合能力大幅度下降，當(dāng)缺失6個(gè)氨基酸時(shí)(184E短肽)，與Mhp天然感染的豬陽性血清幾乎不反應(yīng)，由此可見184短肽缺失5個(gè)氨基酸的184D是P97上一個(gè)B細(xì)胞表位。為了驗(yàn)證184D表位在豬體內(nèi)誘導(dǎo)的抗體免疫應(yīng)答是否具有普遍性，將184D表位展示在酵母表面，然后用隨機(jī)挑選的6份Mhp陽性豬血清進(jìn)行染色，如圖7所示，184D表位能與所有Mhp天然感染的豬陽性血清反應(yīng)，該結(jié)果表明184D表位是P97蛋白上一個(gè)通用表位。

無填充的峰型為陰性對照；灰色填充的峰型為P97酵母隨機(jī)展示文庫的C-Myc抗體染色Open histogram: Negative control; Filled histogram:The yeast random display library of P97 protein stained with Mab against C-Myc圖5 P97酵母隨機(jī)展示文庫誘導(dǎo)表達(dá)的流式分析Fig.5 P97 fragments expression analysis using flow cytometric after induction

表2184號抗原肽及其部分缺失肽氨基酸序列

Table2Aminoacidsequencesof184antigenpeptideanditsdeletions

名稱Name氨基酸序列Amino acid sequences184DEKTSSQKDPSTLRAIDFQY184ADEKTSSQKDPSTLRAIDFQ184BDEKTSSQKDPSTLRAIDF184CDEKTSSQKDPSTLRAI184DDEKTSSQKDPSTLRA184EDEKTSSQKDPSTLR

無填充的峰型為陰性對照；灰色填充的峰型展示184、184A、184B、184C、184D和184E酵母克隆的Mhp陽性血清染色Open histogram: Negative control; Filled histogram: 184, 184A, 184B, 184C, 184D and 184E expressed on the yeast clones stained with Mhp-positive porcine sera圖6 184抗原肽中B細(xì)胞表位的鑒定Fig.6 Verify B-cell epitope from 184 antigen peptide

無填充的峰型為陰性對照；灰色填充的峰型展示184D表位的酵母克隆與1～6號Mhp陽性血清反應(yīng)結(jié)果Open histogram: Negative control; Filled histogram: 184D yeast clones stained with No.1-6 Mhp-positive porcine serum against Mhp圖7 酵母展示的184D表位與Mhp天然感染的豬血清反應(yīng)的流式細(xì)胞儀檢測Fig.7 Reaction analysis between epitope 184D expressed on yeast cells and sera of Mhp-infected porcine with FACS

3 討 論

抗原表位是抗原抗體反應(yīng)的基礎(chǔ)，對它們進(jìn)行鑒定可以促進(jìn)我們更深入理解病原在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。目前篩選抗原表位的方法十分多樣，比較成熟的有表面展示技術(shù)和生物信息學(xué)方法預(yù)測技術(shù)。其中酵母表面展示技術(shù)與其他技術(shù)相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，酵母表面展示技術(shù)依賴于真核后翻譯機(jī)制，能夠在抗原蛋白上進(jìn)行糖基化等多種修飾，這是原核表達(dá)系統(tǒng)所不能做到的[14]。其次，抗原表位與抗體相互作用后，可以利用流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)進(jìn)行分析，該方法準(zhǔn)確性高，可以高通量和高效率展開表位的鑒定，而且操作簡單。該方法通過酵母培養(yǎng)，能夠避免蛋白生產(chǎn)和純化等消耗時(shí)間的步驟；最后，將抗原展示在酵母表面可以用于鑒定目的蛋白上用作免疫原的功能區(qū)[15]。

佐藤等[15]首次將酵母展示技術(shù)成功引入到病原蛋白抗原區(qū)的篩選和鑒定研究中，他們通過該技術(shù)對流感病毒的HA蛋白進(jìn)行了抗原區(qū)的分析，成功揭示了該蛋白上在體內(nèi)能誘導(dǎo)抗體免疫應(yīng)答的線性和空間構(gòu)象型抗原區(qū)。后來，用該系統(tǒng)也成功對H5N1病毒、新城疫病毒、沙門菌等病原的蛋白進(jìn)行了抗原區(qū)分析和表位圖譜繪制[16-18]。因此，這些研究證明酵母展示技術(shù)是用于病原蛋白上抗原區(qū)分析的很好平臺。利用酵母展示技術(shù)對病原蛋白的抗原區(qū)分析時(shí)，酵母文庫的構(gòu)建是關(guān)鍵因素之一。本研究中，獲得的酵母文庫的庫容量為106數(shù)量級，我們實(shí)驗(yàn)室的實(shí)踐表明庫容量的大小比基因長度大十倍時(shí)，獲得的酵母文庫就可以覆蓋所有可能的20～100 aa的抗原肽[17-18]。由于p97基因長度為3 279 bp，庫容量遠(yuǎn)大于基因的大小，因此，本試驗(yàn)中構(gòu)建的酵母文庫將不會出現(xiàn)在表位篩選時(shí)漏選的情況。我們所構(gòu)建的文庫，片段大小主要集中在100～250 bp之間，抗原肽序列在30～60 aa之間，B細(xì)胞表位大小大部分在8～20 aa之間，從該酵母庫篩選出的陽性抗原肽更接近精確表位序列，因此大幅降低了進(jìn)一步精確分析表位序列的工作量。本研究的結(jié)果表明用于表位篩選的酵母文庫，其展示的隨機(jī)抗原片段越小越有利于下面的鑒定工作。

p97突變基因經(jīng)DNaseⅠ隨機(jī)消化插入到酵母表達(dá)載體上后，由于編碼框的移碼和存在正反兩個(gè)插入方向，密碼子正常表達(dá)的概率只有1/6，而且由于質(zhì)粒的穩(wěn)定性和培養(yǎng)生長期的不同，實(shí)際情況遠(yuǎn)比這個(gè)比例低[19-21]。本研究中的展示文庫誘導(dǎo)后可以檢測到約5%的陽性率，這一結(jié)果符合以前多次報(bào)道的首次檢測陽性率偏低的現(xiàn)象[15，17-18]。

本研究中篩選到的184抗原肽序列包含有20個(gè) 氨基酸，但是這個(gè)序列不一定是B細(xì)胞表位的最小序列，需要進(jìn)一步通過多肽截短試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。在本試驗(yàn)中將184陽性抗原肽從C端減少6個(gè)氨基酸時(shí)，該抗原肽完全失去了與血清相互作用的功能，由此可見剩下的包含15個(gè)氨基酸的序列為一個(gè)最小的B細(xì)胞表位。在184多肽逐漸變短的184A、184B和184C序列與陽性血清相互作用后，陽性率逐漸變小，這說明在184序列中可能包含有不同的抗原表位，它們在截短過程中，有些表位被破壞使相同血清結(jié)合的抗體數(shù)量變少。我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測到184D抗原表位與6份來源于不同宿主的Mhp陽性豬血清均發(fā)生作用，說明184D抗原表位具有普遍性。之前的研究報(bào)道表明P97蛋白的免疫原性主要在該蛋白的R1區(qū)。然而，本試驗(yàn)利用Mhp天然感染的豬陽性血清篩選到的表位序列并不位于P97 R1區(qū)，因此我們推測P97蛋白上可能還存在其他重要的抗原區(qū)，這一結(jié)果對于我們將來利用P97設(shè)計(jì)疫苗和開發(fā)診斷試劑盒的研發(fā)具有指導(dǎo)作用。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建P97蛋白酵母隨機(jī)展示文庫，利用該文庫篩選和鑒定到一個(gè)長度為15個(gè)氨基酸的184D(DEKTSSQKDPSTLRA)多肽，它是P97上一個(gè)在宿主體內(nèi)能普遍誘導(dǎo)抗體免疫應(yīng)答的B細(xì)胞表位，本研究對于研發(fā)Mhp的表位疫苗和建立特異性診斷方法具有重要意義。