釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取及抗氧化、抗腫瘤活性研究

王虹玲，吳 優(yōu)，于子簫，康振宇，趙奕彭，康宗利*

（1.沈陽(yáng)工學(xué)院 生命工程學(xué)院，遼寧 撫順 113122；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；3.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

釀酒葡萄皮渣中含有大量與葡萄酒類似的生物活性物質(zhì)，尤以多酚類化合物為主（如白藜蘆醇、原花青素、酒石酸等），這些物質(zhì)都具有較強(qiáng)的抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老等生物活性，已成為世界性的重要營(yíng)養(yǎng)兼藥用的商品[1-5]。白藜蘆醇是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄屬、花生屬等植物中，以虎杖、葡萄中含量最多，而在葡萄中又以葡萄皮中的含量最高[6-10]。

目前，白藜蘆醇提取常見的方法有有機(jī)溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助法、酶解法等。由于自然界中白藜蘆醇的含量較低，通常在提取前需要對(duì)提取對(duì)象進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，如將樣本中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇多聚體衍生物通過(guò)酸堿水解或酶解轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，可大大提高白藜蘆醇提取率[11-12]。

本研究以自釀葡萄酒發(fā)酵后的皮渣為原材料，將皮渣干燥后磨粉過(guò)篩，利用纖維素酶解法在不同條件下進(jìn)行白藜蘆醇的提取，并對(duì)提取得到的白藜蘆醇進(jìn)行抗氧化及體外抗腫瘤活性分析，以期為葡萄皮渣資源的利用以及白藜蘆醇產(chǎn)品的深度開發(fā)奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄皮渣：康美爾葡萄經(jīng)葡萄酒發(fā)酵后濾出清液所得。人宮頸癌Hela細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞：均由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)提供。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純），纖維素酶（酶活105U/g）、鄰二氮菲、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鋁、乙酸乙酯（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：予華儀器有限公司；W200IR型CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)SIM公司；TS-100倒置顯微鏡：日本Nikon公司；Stat Fax-3200酶標(biāo)儀：美國(guó)AWARENESS公司；1-15K高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

釀酒葡萄皮渣粉末：新鮮釀酒葡萄皮渣經(jīng)紗布過(guò)濾去除殘余水分后，50℃烘干至質(zhì)量恒定，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，得到的皮渣粉，末加入石油醚進(jìn)行脫脂處理；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚，得到的葡萄皮渣粉末裝入密封容器內(nèi)備用。

纖維素酶解：準(zhǔn)確稱取釀酒葡萄皮渣粉末1.0g于100mL燒杯中，加入一定量的蒸餾水和纖維素酶在50℃、pH 5.0條件下酶解1 h。

體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸提：酶解后加入一定量體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，浸提一段時(shí)間后離心去除濾渣。

白藜蘆醇粗提液：濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，得到白藜蘆醇粗提液。

白藜蘆醇浸膏：白藜蘆醇粗提液中加入乙酸乙酯，反復(fù)萃取3次，合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙酸乙酯，得到白藜蘆醇浸膏。

目標(biāo)產(chǎn)物：白藜蘆醇浸膏于50℃條件下烘干至質(zhì)量恒定，進(jìn)行含量測(cè)定。

1.3.2 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

以釀酒葡萄皮渣為原料，分別以纖維素酶添加量（30U/μL、50U/μL、70U/μL、90U/μL、110U/μL、130U/μL）、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇與葡萄皮渣液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL∶g））、酶解時(shí)間（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）、酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70℃、80℃）為評(píng)價(jià)因素，白藜蘆醇提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取的單因素試驗(yàn)。

1.3.3 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）的設(shè)計(jì)原理，利用Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以酶添加量（A）、液固比（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）為考察因素，以釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化酶解條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

1.3.4 測(cè)定方法

白藜蘆醇含量：參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行測(cè)定；

DPPH自由基清除能力：以維生素C（vitamin C，VC）作為對(duì)照，參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測(cè)定；

超氧陰離子自由基清除能力：以VC作為對(duì)照，參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行測(cè)定；

體外抗腫瘤活性：參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖1 纖維素酶添加量對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on the extraction rate of resveratrol

由圖1可知，白藜蘆醇提取率隨酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)；當(dāng)酶的添加量為70 U/μL時(shí)，白藜蘆醇提取率達(dá)到最高，為142.82 μg/g。繼續(xù)增加酶添加量，葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。表明此時(shí)溶液中酶的添加量已近于飽和。因此，選擇酶添加量為70 U/μL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 液固比對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

由圖2可知，白藜蘆醇提取率隨液固比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)液固比為25∶1（mL∶g）時(shí)，白藜蘆醇提取率達(dá)到最高，為139.82 μg/g。繼續(xù)增加液固比，反應(yīng)體系中酶的濃度逐漸稀釋，降低了酶解作用效果，導(dǎo)致白藜蘆醇提取率逐漸降低。因此選擇液固比為25∶1（mL∶g）。

圖2 液固比對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of resveratrol

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the extraction rate of resveratrol

由圖3可知，白藜蘆醇提取率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí)，白藜蘆醇提取率達(dá)到最高，為142.48 μg/g。繼續(xù)增加酶解時(shí)間，葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率并沒有明顯提高。此時(shí)，細(xì)胞壁已基本被破壞，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)試驗(yàn)效果影響不顯著（P＞0.05）。因此選擇酶解時(shí)間為90 min。

2.1.4 酶解溫度對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的影響

圖4 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of resveratrol

由圖4可知，白藜蘆醇提取率隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，白藜蘆醇提取率達(dá)到最高，為129.63 μg/g。當(dāng)酶解溫度＞50℃時(shí)，酶的活性受到嚴(yán)重影響，高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu)，影響了酶對(duì)細(xì)胞壁的分解作用，抑制了白藜蘆醇的提取。因此，選擇酶解溫度為50℃。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析分別見表2和表3。

表2 釀酒葡萄皮渣酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for wine grape pomace hydrolysis conditions optimization

從表3可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9193，R2=0.9583，表明該模型與試驗(yàn)擬合較好，可以用于葡萄皮渣中白藜蘆醇提取率的預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，各試驗(yàn)因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響為A＞B＞C＞D，交互項(xiàng)除AD外其余各項(xiàng)均極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)除C2外均極顯著（P＜0.01）。模型所預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取條件為酶添加量70.16 U/μL，酶解時(shí)間148.43 min，酶解溫度39.80 ℃，液固比18.16∶1（mL∶g），在此條件下，白藜蘆醇的提取量為141.48 μg/g。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression model

對(duì)各試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸模型方程為：Y=139.46+5.76A-4.91B+1.20C-0.78D+3.98AB+4.13AC+2.01AD+-9.84BC-4.98BD-5.46CD-5.36A2-3.99B2-1.29C2+2.48D2

2.2.2 交互作用分析

釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇提取工藝優(yōu)化的響應(yīng)面及等高線圖如圖5所示。

由圖5可知，酶添加量和液固比的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定的液固比條件下，提取量隨酶添加量的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶添加量和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在不同的酶解時(shí)間下，提取量隨酶添加量的升高而逐漸降低。固液比和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定酶解溫度條件下，提取量隨液固比的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。酶解時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在一定的酶解溫度下，提取量隨酶解時(shí)間的增大呈逐漸減少的趨勢(shì)。液固比和酶解時(shí)間的交互作用對(duì)白藜蘆醇的提取量影響極顯著（P＜0.01）；在不同的液固比條件下，提取量隨酶解時(shí)間的增大而逐漸減少。

圖5 酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、液固比交互作用對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between cellulase addition,enzymolysis time,temperature and solid-liquid ratio on resveratrol content from wine grape pomace

2.2.3 最佳提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的結(jié)果，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作，將考察因素設(shè)定為酶添加量為70 U/μL，酶解時(shí)間為150 min，酶解溫度為40 ℃，液固比為20∶1（mL∶g），重復(fù)3次試驗(yàn)，得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g，與模型預(yù)測(cè)值141.48 μg/g接近，證實(shí)了模型的有效性。

2.3 葡萄皮渣中白藜蘆醇的抗氧化活性分析

由圖6A可知，VC和白藜蘆醇均對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果，且清除率隨抗氧化劑濃度的增加而呈上升趨勢(shì)。其中VC在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除效果優(yōu)于白藜蘆醇，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，VC的清除率可達(dá)（88.03±2.251）%，白藜蘆醇的清除率為（65.12±3.882）%。

圖6 不同質(zhì)量濃度的VC及白藜蘆醇對(duì)DPPH（A）和超氧陰離子（B）自由基的清除效果Fig.6 Scavenging capacities of different concentrations of VC and resveratrol on DPPH free(A)and superoxide anion(B)free radicals

由圖6B可知，不同濃度的白藜蘆醇均具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，并隨質(zhì)量濃度的不斷增大，清除率逐漸升高，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.2mg/mL時(shí)白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到最大，為（54.13±3.105）%，陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)超氧陰離子自由基的最大清除率為（86.58±2.975）%。白藜蘆醇對(duì)超氧陰離子自由基的抗氧化性雖不及VC，但也表現(xiàn)出一定的清除效果。

2.4 葡萄皮渣中白藜蘆醇的體外抗腫瘤活性分析

采用MTT法測(cè)定葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)3種癌細(xì)胞Hela、A549和PC-3的體外抑制活性，并根據(jù)抑制率計(jì)算半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值，結(jié)果見表4。

表4 白藜蘆醇對(duì)3種腫瘤細(xì)胞株的IC50值Table 4 IC50value of the three tumor cell strains treated with resveratrol

由表4可知，白藜蘆醇對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的抑制最為顯著，IC50值最小，為25.31 μmol/L；對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的IC50值分別為128.29 μmol/L和108.35 μmol/L。

3 結(jié)論

本研究采用纖維素酶水解法對(duì)釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取條件為酶添加量70 U/μL，酶解時(shí)間150 min，酶解溫度40 ℃，液固比20∶1（mL∶g），重復(fù)3次試驗(yàn)，得到葡萄皮渣中白藜蘆醇的提取率為144.13 μg/g。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，釀酒葡萄皮渣中白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度的增加而升高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH和超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到（65.12±3.882）%和（54.13±3.105）%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

體外抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果表明，釀酒葡萄皮渣中的白藜蘆醇對(duì)Hela、A549和PC-3細(xì)胞的增長(zhǎng)具有抑制作用，其IC50值分別為128.29μmol/L、108.35 μmol/L和25.31 μmol/L，表現(xiàn)出一定的體外抗腫瘤活性。