癲癇(Epilepsy，Ep)是由多種原因?qū)е碌穆苑磸?fù)發(fā)作性短暫腦功能失調(diào)綜合征，以腦神經(jīng)元異常放電為主要特征的神經(jīng)退行性病變，被WHO列為重點(diǎn)防治的五大神經(jīng)疾病之一，它嚴(yán)重危害人類的健康，影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床治療癲癇的方法有多種，如手術(shù)、抗癲癇藥物等，然而大約三分之一的癲癇患者仍然無法控制癲癇發(fā)作[1，2]，因此，開發(fā)癲癇的新療法，更好地了解癲癇發(fā)生機(jī)制顯得尤為重要。目前MicroRNAs(miRNA)為癲癇發(fā)生及治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和生物標(biāo)志物尋找的研究熱點(diǎn)。

miRNA是一類內(nèi)源基因編碼的單鏈的非編碼小RNA，在動(dòng)植物及微生物等低等生物中廣泛存在，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和器官生成等重要過程中承擔(dān)著關(guān)鍵性的調(diào)控功能。這些短RNA能與靶基因的mRNA配對(duì)并阻礙其翻譯，可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。最近的研究表明miRNA能參與腦功能的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)炎癥[3]、突觸重建[4]、神經(jīng)元凋亡[5]等。有研究表明miRNA34a可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱為細(xì)胞程序性死亡，在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起至關(guān)重要的作用。而Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中十分重要的一員，可以參與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的起始階段[6]，并且Bcl-2是抗凋亡蛋白可以阻止細(xì)胞凋亡這已經(jīng)是不爭(zhēng)的事實(shí)[7]。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬中Bcl-2明顯下調(diào)[8]。

為此我們探討miRNA34a是否可在癲癇中通過調(diào)節(jié)Bcl-2影響大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響癲癇的發(fā)作，這將有助于人們更好的了解癲癇的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 將24只健康雄性Wister大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué))飼養(yǎng)在佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心并隨機(jī)分為兩組，每組12只。正常組(NC組)每天只接受腹腔注射生理鹽水，癲癇組(Ep組)每天腹腔注射戊四氮(40 mg/kg)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作模擬人顳葉癲癇[9]。

1.1.2 藥品及試劑 miR34a引物由上海生物工程有限公司合成：miRNA34a序列如下：正向：5’- ATACCGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTTCTTT-3’、反向：5’-ATACCGCTCGAGCCTGTGCCTTTTTCCTTCC-3’;u6引物由miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒提供。RNAeasyTM動(dòng)物小RNA抽提試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生物工程有限公司);熒光定量PCR試劑盒(上海生物工程有限公司);Rabbit Anti Bcl-2(USA affinity)、Mouse Anti β-actin、Goat Anti-Mouse IgG、Goat Anti-Rabbit IgG(武漢博士德生物有限公司);彩虹245廣譜蛋白Marker、PMSF(北京索萊寶科技有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、戊四氮(Sigma)。其他試劑均由分子實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要儀器 組織切片機(jī)LEICA-RM2025(德國Leitz);電泳儀DYY-8C、垂直電泳槽DYCZ-24DN、濕法轉(zhuǎn)膜槽DYCZ-40(北京六一生物科技);ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國);熒光顯微鏡DMI4000B (德國Lecia)等。

1.2 方 法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立及Racine等級(jí)評(píng)分 24只(220±20) g健康雄性Wister大鼠，采用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分成2組，每組12只。正常組(NC組)每天只接受腹腔注射生理鹽水，癲癇組(Ep組)每天腹腔注射戊四氮(40 mg/kg)建立癲癇模型，連續(xù)注射28 d，每天觀察大鼠的Racine評(píng)分等級(jí)(Racine等級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1)。驚厥評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)3 d出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及Ⅳ級(jí)以上評(píng)分的大鼠視為達(dá)到癲癇模型的標(biāo)準(zhǔn)。在最后一次施用藥物的24 h后，用0.1 g/ml的水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉大鼠。采用隨機(jī)數(shù)字表法將每組大鼠隨機(jī)分為2組，一組大鼠心臟灌注固定取腦，左右大腦半球置于4%多聚甲醛中固定，另一組大鼠斷頭分離海馬，將分離好的海馬置于液氮中保存。

表1 Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 生物信息學(xué)分析癲癇大鼠海馬中差異表達(dá)的miRNA 從在線GEO數(shù)據(jù)庫(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/)中獲取GSE49851的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，采用GEO數(shù)據(jù)庫中的GEO2R分析30 d癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠與對(duì)照組大鼠的差異表達(dá)基因，采用默認(rèn)的BenjaminiHochberg方法計(jì)算FDR，篩選FDR<0.05且排名前10位差異表達(dá)miRNA。

1.2.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可以調(diào)控Bcl-2的miRNA 通過DIANA Tools(http：//diana. imis. athenainnovation. gr/Diana Tools/index，php)和TargetScan(http：//www. targetscan. org/)預(yù)測(cè)可以靶向結(jié)合Bcl-2的上游序列的miRNA。再取與1.2.2分析結(jié)果有交集的miRNA進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)大鼠海馬中miRNA34a的表達(dá)情況 稱取5 mg的海馬組織應(yīng)用RNAeasyTM動(dòng)物小RNA抽提試劑盒提取miRNA，用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將提取的miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用miRNA熒光定量PCR試劑盒將得到的cDNA擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s、退火/延伸60 ℃ 30 s、循環(huán)40次。采用2-△△Ct法分析比較miRNA34a在正常大鼠海馬組織和癲癇大鼠海馬組織中的表達(dá)情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠海馬中Bcl-2的表達(dá)情況 稱取30 mg的海馬組織并加入270 μl的裂解液，使用研磨機(jī)將海馬組織研碎后，靜置30 min(4 ℃)，14000 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清液。用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混勻放入95 ℃的水浴鍋中水浴10 min充分變性后恢復(fù)至室溫。將樣本于SOD-PAGE凝膠電泳(15%分離膠，5%壓縮膠)，電泳至溴酚藍(lán)離膠板最下端1 cm處停止。并按照marker和目的蛋白的分子量來切膠。轉(zhuǎn)膜：將PVDF膜裁剪合適的大小，甲醇浸潤15 s，用電轉(zhuǎn)液將纖維層和濾紙浸濕。按照陰極-纖維層-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-纖維層-陽極順序制作“三明治”，用恒流270 mA進(jìn)行電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜完畢后放入 5%脫脂奶粉封閉1.5 h(37 ℃)。一抗孵育4 ℃過夜(β-actin 1：1000，Bcl-2 1：200)。TBST 5 min/遍，洗3遍。二抗室溫孵育1 h(HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 1：1000 HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 1：1000)。TBST 5 min/遍，洗3遍，ECL曝光。用相對(duì)灰度值(目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值)表示Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.6 Hoechst檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況 從4%多聚甲醛中取出固定好的腦組織，取視交叉后4～5 mm即海馬平面。進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)，烤片，石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟后用枸櫞酸鹽緩沖液水浴97 ℃ 15 min。PBS洗兩遍，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。去除染色液，用PBS洗兩遍，每次3 min。滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡拍照(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)。Hoechst染色后，凋亡細(xì)胞核出現(xiàn)凝聚(固縮)和亮藍(lán)色(藍(lán)白色)。用ipp 6.0查同一片區(qū)域陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，用陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%表示細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 Racine 評(píng)分等級(jí) 與NC組相比Ep組大鼠的Racine評(píng)分明顯高于NC組(**P<0.01)，并且癲癇大鼠的Racine評(píng)分的Ⅳ級(jí)次數(shù)超過3次。(見圖1)

圖1 NC組與Ep組大鼠的Racine評(píng)分

2.2 癲癇大鼠海馬中差異表達(dá)的miRNA 通過GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE49851的表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選出癲癇大鼠海馬中高差異性表達(dá)前十位miRNA(見表2)。

表2 癲癇大鼠海馬中高差異性表達(dá)的前十位miRNA

2.3 靶向Bcl-2的miRNA 通過DIANA Tools和TargetScan尋找可以靶向Bcl-2的miRNA結(jié)果再與2.2的結(jié)果取交集發(fā)現(xiàn)miRNA34a是唯一可以直接靶向Bcl-2的miRNA(見圖2)。

圖2 靶向Bcl-2的高表達(dá)的miRNA-34a

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬組織中miRNA34a表達(dá)量的結(jié)果 與NC組相比Ep組大鼠海馬中的miRNA34a表達(dá)量明顯高于NC組(P<0.01;**)(見圖3)。

2.5 大鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)量 與NC組相比Ep組大鼠海馬中的Bcl-2表達(dá)量明顯低于NC組(**P<0.01)(見圖4)。

2.6 大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡情況 與NC組相比 Ep組大鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元的凋亡率明顯大于NC組(**P<0.01)(見圖5)。

圖3 Q-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織中miRNA34a表達(dá)量

圖4 Western blot法檢測(cè)的Bcl-2表達(dá)量

圖5 a：大鼠CA1區(qū)Hoechst染色情況;b：大鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元的凋亡率

3 討 論

癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜且影響因素較多，目前通常認(rèn)為與神經(jīng)元死亡、神經(jīng)元再生、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞再生、離子通道改變以及神經(jīng)炎癥有關(guān)[9]。本項(xiàng)目探討miRNA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元產(chǎn)生的影響，這有助于我們進(jìn)一步了解癲癇的發(fā)病機(jī)制。

戊四氮(Pentetrazol，PTZ)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，對(duì)整個(gè)腦脊髓軸有影響。它可以引發(fā)全身強(qiáng)直- 陣攣性發(fā)作，PTZ點(diǎn)燃大鼠的癲癇模型與人類癲癇發(fā)作十分相似，具有病理反應(yīng)局灶部位的確定性、漸進(jìn)性、穩(wěn)定性和持久性等優(yōu)點(diǎn)，并且PTZ本身無神經(jīng)毒性，不會(huì)直接造成神經(jīng)元的損傷[10]，綜上所述PTZ誘導(dǎo)的癲癇鼠符合我們的實(shí)驗(yàn)要求，是理想的癲癇動(dòng)物模型。為此我們選用PTZ誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型，研究miRNA34a對(duì)癲癇大鼠的影響及其可能的發(fā)病機(jī)制。

評(píng)價(jià)癲癇模型是否建立成功的方法有多種但大致分為2種：一種是腦電圖;另一種是行為評(píng)分。其中行為評(píng)分在評(píng)估各種癲癇動(dòng)物模型中是十分常見的，而Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是行為評(píng)分中最常用的方法之一[11，12]。在我們的實(shí)驗(yàn)中Ep組大鼠的Racine評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)3 d出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及Ⅳ級(jí)以上Racine評(píng)分，這證明癲癇大鼠的模型建立成功，并且通過比較Ep組大鼠和正常對(duì)照組大鼠的Racine評(píng)分結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)Ep組大鼠與NC組大鼠在行為學(xué)上有明顯的差別。

MicroRNAs(miRNA)是一類重要的非編碼小RNA(～22nt)，可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。其通過結(jié)合基因中的保守序列對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。它們對(duì)胚胎發(fā)育及正常細(xì)胞生理學(xué)至關(guān)重要。已有研究顯示miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，且miRNA功能障礙與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[13]。2012年T Sano在大腦杏仁核內(nèi)顯微注射紅藻氨酸的癲癇模型中發(fā)現(xiàn)癲癇可以誘導(dǎo)miRNA34a上調(diào)[14]，這與我們PTZ致癲癇鼠中miRNA34a表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致，這說明癲癇可以誘導(dǎo)miRNA34a的上調(diào)。

癲癇發(fā)作和癲癇的持續(xù)狀態(tài)都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的缺失[15]。Pitk?nen A等人發(fā)現(xiàn)在癲癇患者腦內(nèi)的海馬體積會(huì)逐漸變小[16]，這種神經(jīng)元的缺失可導(dǎo)致認(rèn)知功能發(fā)生障礙，并且會(huì)加重癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。最重要的是神經(jīng)元缺失與癲癇的發(fā)作直接相關(guān)[17]。有研究證實(shí)細(xì)胞凋亡可能是誘導(dǎo)神經(jīng)元缺失的重要原因[15，18]，而Bcl-2蛋白是Bcl-2家族中十分重要的一員，其主要功能是參與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的起始階段[6]，Bcl-2可與Bax和BH3-only蛋白結(jié)合防止線粒體外膜透化進(jìn)而阻止細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活caspase，最終達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的作用[19，20]。在我們的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)癲癇鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，且CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率增加，說明持續(xù)癲癇可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的損傷。

我們通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠海馬組織中差異性表達(dá)前10的miRNA中miRNA34a是唯一靶向Bcl-2的miRNA，并且其miTG score 高達(dá)0.99以上;最近Lin已證實(shí)miRNA34a可以靶向Bcl-2[21]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)Ep組大鼠海馬組織中miR34a的表達(dá)量明顯高于NC組(P<0.01)、Bcl-2的表達(dá)量明顯低于NC組(P<0.01)、海馬神經(jīng)元凋亡情況明顯高于NC組(P<0.01)。綜合以上結(jié)果，我們推測(cè)miRNA34a對(duì)癲癇大鼠海馬神經(jīng)元具有損傷神經(jīng)元的作用，并且其作用機(jī)制可能是miRNA34a下調(diào)Bcl-2表達(dá)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡進(jìn)而對(duì)癲癇大鼠產(chǎn)生影響，但如果要明確miRNA34a對(duì)癲癇大鼠的影響還需要進(jìn)行大量的深入研究。本研究將有助于人們更好的了解癲癇的發(fā)生機(jī)制，為臨床上治療癲癇提供新的治療靶點(diǎn)。