張永芳，李富恒，王潤(rùn)梅，令狐梅

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西大同037009；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150000）

目前關(guān)于小米黃色素提取的研究報(bào)道較多，諸如王海棠等[1]采用傳統(tǒng)方法即有機(jī)溶劑提取小米黃色素，趙猛等[2]應(yīng)用超聲波技術(shù)提取黃色素，但是通過微波技術(shù)萃取小米黃色素的報(bào)道很少。本文采用微波輔助萃取技術(shù)從小米中提取黃色素并確定其最佳工藝。微波技術(shù)因其選擇性強(qiáng)、加熱速度快、便于控制、受熱溫度均勻、能耗低、節(jié)省操作成本的同時(shí)又低碳環(huán)保，所以在食品、化學(xué)合成分析、環(huán)保等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

東方亮小米，由山西廣靈東方物華農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.2 主要試劑

無水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸均為分析純；鎂粉。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

微波爐EG720KG4-NA，廣東美的微波電器制造有限公司；80-3離心機(jī)、數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；XFB-200小型粉碎機(jī)，吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；RE-5211旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZD型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；JH1102電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

將小米粉5.00 g放入錐形瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定好的料液比加入一定量體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在恒溫水浴鍋中40℃浸提1 h，再在設(shè)定好的微波功率下微波輻射60 s使黃色素充分釋放，靜置棄去下層的沉淀，以4 000 r/min離心上清液10 min，得到含有黃色素的乙醇提取液在最大吸光值處測(cè)其吸光度值。

得到的色素提取液通過減壓蒸餾得到濃縮后的高濃度小米黃色素溶液，再在烘箱中40℃烘干，最終得到黃色的粉末。這既可以回收乙醇又可以收獲小米黃色素粉末。

1.4.2 檢測(cè)分析

1.4.2.1 小米黃色素吸收波長(zhǎng)的選擇

對(duì)離心分離出的含黃色素的乙醇溶液，在不同的波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值，設(shè)定波長(zhǎng)分別為400、415、430、445、460、475、490、505 nm。 以體積分?jǐn)?shù)為90%醇為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.4.2.2 小米黃色素的特殊顯色反應(yīng)

1)濃鹽酸顯色反應(yīng) 用實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下制得的小米黃色素粉末配置成乙醚溶液，緩緩地加入濃鹽酸，振蕩片刻，觀察現(xiàn)象；

2)濃硫酸顯色反應(yīng) 用實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下制得的小米黃色素粉末配置成乙醚溶液，緩緩加入濃硫酸，觀察現(xiàn)象；

3)鹽酸-鎂粉反應(yīng) 取實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下制得的小米黃色素的乙醇提取液5 mL到試管中，加入少許鎂粉振蕩，再用移液管加入幾滴鹽酸，觀察現(xiàn)象[3]。

1.4.2.3 小米黃色素含量的測(cè)定

對(duì)收獲的黃色粉末進(jìn)行稱量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。小米黃色素含量按下列公式計(jì)算：

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用單因素實(shí)驗(yàn)，研究微波輻射功率、微波輻射時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)小米黃色素提取液的吸光度的影響，并對(duì)4個(gè)因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

4個(gè)因素的實(shí)驗(yàn)范圍為:設(shè)定微波輻射功率為140、280、420、560、700 W；輻射時(shí)間為30、40、50、60、70、80；料液比為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%、95%無水乙醇。

以1.4.2.1所選定的波長(zhǎng)作為檢測(cè)的吸收波長(zhǎng)，并以吸光度值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。每一個(gè)因素重復(fù)進(jìn)行3次取平均值。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取3個(gè)因素并對(duì)每一個(gè)因素選取3個(gè)水平，利用Design Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化微波萃取工藝。

以微波輻射時(shí)間、微波輻射功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)作為優(yōu)化的3個(gè)因素，以小米黃色素提取液的吸光度為響應(yīng)值。水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 微波輔助提取小米中黃色素的因素水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

按照1.4.2.1三組重復(fù)實(shí)驗(yàn)得不同波長(zhǎng)下的吸光度值取平均值，將其繪制為圖1?？梢钥闯?，小米黃色素的乙醇提取液的吸光度在波長(zhǎng)445 nm時(shí)為最大值，因此選用445 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)較為合適。

圖1 微波提取小米黃色素最大波長(zhǎng)的確定

2.2 色素顯色反應(yīng)現(xiàn)象及結(jié)果分析

采用在最佳工藝條件下制得的小米黃色素粉末，配置成的乙醚溶液，并采用在最佳工藝條件下提取的小米黃色素的乙醇提取液，進(jìn)行顯色反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果分析見表2。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)微波小米黃色素提取效果的影響

稱量適量小米粉，料液比設(shè)為1∶10，以乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的差異作為控制因素，研究其對(duì)吸光度的影響。按1.4.1的工藝流程，40℃恒溫水浴，浸提1 h，設(shè)定微波功率350 W，微波時(shí)間60 s，微波輻射提取小米黃色素，最后離心分離得含黃色素的乙醇溶液。從圖2看出，微波萃取獲得的提取液吸光度隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而提高，但使用無水乙醇作提取液時(shí)吸光度有降低趨勢(shì)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)微波提取小米黃色素的影響

2.3.2 料液比對(duì)微波萃取小米黃色素效果的影響

稱取適量小米粉，以90%乙醇溶液作提取液微波輻射60 s，設(shè)定不同料液比研究其對(duì)吸光度的影響。提取過程參照1.4.1，通過對(duì)料液比的控制，可達(dá)到對(duì)提取過程中傳質(zhì)推動(dòng)力的控制，從而有效的改變提取效果[4]。從圖3看出，在微波提取過程中小米黃色素提取的效果與料液比的增加呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，但當(dāng)料液比增加到1∶7之后，提取液的吸光度基本上沒有變化。這可能與料液的飽和度有關(guān)。故最終實(shí)驗(yàn)選取的料液比為1∶7。

表2 色素顯色反應(yīng)的現(xiàn)象及結(jié)果分析

圖3 料液比對(duì)微波提取小米黃色素的影響

圖4 微波輻射功率對(duì)微波提取小米黃色素的影響

2.3.3 微波輻射功率對(duì)微波萃取小米黃色素效果的影響

稱取適量小米粉，以90%乙醇溶液作提取液微波輻射60 s，設(shè)定不同微波輻射功率研究其對(duì)吸光度的影響。從圖4看出，增大微波輻射的功率有利于小米黃色素的浸出，輻射功率560 W時(shí)提取液的吸光度達(dá)到最大值，繼續(xù)增大微波輻射功率提取液的吸光度有所下降。故最終實(shí)驗(yàn)選取的微波輻射功率為560 W。這可能是因?yàn)檩椛涔β实母叩团c提取液吸收微波能的多少和微波對(duì)色素結(jié)構(gòu)的破會(huì)程度有關(guān)。增大功率有利于有效成分溶出，但功率過高時(shí)，強(qiáng)熱效應(yīng)對(duì)有效成分的破壞程度也會(huì)隨著增加，從而使再增大功率提取效果并不是很好[5]。最終實(shí)驗(yàn)選取的提取功率為560 W。

2.3.4 微波輻射時(shí)間對(duì)微波萃取小米黃色素效果的影響

稱取適量小米粉末，以90%乙醇溶液作提取液微波輻射60 s，設(shè)定料液比為1∶10，研究不同微波時(shí)間對(duì)小米黃色素提取液吸光度的影響。從圖5看出，微波輻射時(shí)間增加到70 s時(shí)，吸光度達(dá)到最大，繼續(xù)增大微波輻射時(shí)間，吸光度開始下降。分析可能是因?yàn)槲⒉ㄝ腿r(shí)間的延長(zhǎng)加大了微波對(duì)色素結(jié)構(gòu)的破壞。故最終實(shí)驗(yàn)選取的微波輻射時(shí)間為70 s。

圖5 微波輻射時(shí)間對(duì)微波提取小米黃色素的影響

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取小米黃色素工藝

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)提取效果影響較大的3個(gè)因素，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件的Box—Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以3因素3水平的方式進(jìn)行優(yōu)化。從以上的單因素分析可以看出，當(dāng)料液比增至1∶7時(shí)，作為響應(yīng)值的吸光度并沒有增加的趨勢(shì)，而其余3個(gè)因素都可以取到最高峰，所以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以1∶7作為最佳提取料液比，以其余3因素作為對(duì)微波提取小米黃色素的影響顯著的因素。水平設(shè)計(jì)見1.6所設(shè)計(jì)的表1。設(shè)計(jì)分析的結(jié)果見表3。

表3 微波輔助提取小米黃色素的工藝優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

以表3所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行二次回歸分析，得到以吸光度為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程的模型為:R=0.75-0.048×A+0.024×B+0.029×C-9.750×E-003×A×B+4.250×E-003×A ×C-0.023×B×C-0.16×A2-0.028×B2-0.063×C2(R表示吸光度)。

表4為響應(yīng)面的二次回歸模型的方差分析。該模型的P值小于0.000 1，表示該模型顯著，也就是說該回歸方程可以很好地表示微波輻射時(shí)間、微波輻射功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)這3個(gè)因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)探究的最終目的可以通過該回歸方程確定。

從方差分析表可以看出，其中對(duì)該模型影響極顯著有一次項(xiàng)中的A、B、C與二次項(xiàng)中的A2和C2對(duì)，對(duì)該模型影響顯著有交互項(xiàng)中的BC和二次項(xiàng)中的B2。

利用Design Expert 8.0.6軟件得出各交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)面圖是一個(gè)三維空間曲線圖，可以從響應(yīng)面圖的傾斜程度和曲面顏色加深趨勢(shì)等方面來判斷因素間交互作用的顯著性。曲面的傾斜程度則反映了各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，越陡表明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大。等高線圖相當(dāng)于響應(yīng)面圖的投影，其性狀反映了各因素交互的強(qiáng)弱程度[6]。等高線上各點(diǎn)處的提取方案，實(shí)驗(yàn)得到的色素吸光度與理論上相同。

表4 方差表的響應(yīng)面二次型方差分析的方差分析

圖6～8反映了實(shí)驗(yàn)設(shè)定的交互項(xiàng)與響應(yīng)值間的交互關(guān)系響應(yīng)面圖和等高線圖。通過對(duì)3組圖的比較可知，微波輻射時(shí)間、微波輻射功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)小米黃色素提取效果的影響依次降低。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)多角度全方位的考慮到實(shí)驗(yàn)設(shè)定的各因素與提取液吸光度間的內(nèi)在聯(lián)系，通過方差分析和三維圖直觀反映之間的規(guī)律，達(dá)到立體直觀，高效快捷的效果。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件的Box—Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定萃取的最佳參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)94%，微波輻射時(shí)間74 s，微波輻射功率580 W，在此條件下小米黃色素提取液的吸光度可達(dá)0.759，最終得率可達(dá)10.23%。顯色反應(yīng)表明小米黃色素中除了含有類胡蘿卜素外，還含有黃酮類物質(zhì)。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波輻射時(shí)間交互項(xiàng)響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波輻射功率交互項(xiàng)響應(yīng)面圖和等高線圖

圖8 微波輻射功率和微波輻射時(shí)間交互項(xiàng)響應(yīng)面圖和等高線圖

微波輔助提取小米黃色素可以很大程度上縮短提取時(shí)間、降低能耗、提高提取效，使結(jié)果具有應(yīng)用價(jià)值；采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化，系統(tǒng)全面地考慮到了各實(shí)驗(yàn)因素，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的應(yīng)用有了一定的依據(jù)；對(duì)于開發(fā)低成本、低能耗、高效率的小米黃色素提取工藝具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)價(jià)值；對(duì)天然色素的獲取提供了新的思路。