李日美 申光榮 黃 放 楊奇慧* 譚北平 董曉慧

(1.廣東海洋大學水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，湛江 524088；2.深圳市裕農(nóng)科技股份有限公司，深圳 518110)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，別名白腳對蝦、凡納對蝦，原產(chǎn)于厄瓜多爾，生活在熱帶、亞熱帶、暖溫帶和溫帶海域[1]。凡納濱對蝦是當前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一，它具有生長快、抗病能力強、養(yǎng)殖經(jīng)濟效益顯著、環(huán)境適應(yīng)能力強、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點，是華南地區(qū)主要的對蝦養(yǎng)殖品種。然而，在對蝦養(yǎng)殖過程中，隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高，環(huán)境污染等問題造成養(yǎng)殖水質(zhì)變差；魚粉價格提高，飼料中魚粉含量和蛋白質(zhì)水平的不斷降低，嚴重影響了對蝦的生長，還導致了疾病頻發(fā)等問題。因此，促進對蝦生長及提高其免疫力和抗病力的研究成為關(guān)注熱點。

小肽，也稱寡肽、微肽、短肽，一般是指由2個以上氨基酸組成的寡肽，來源主要有天然及通過水解蛋白質(zhì)獲得[2]。研究表明，蛋白質(zhì)在消化道中的消化終產(chǎn)物往往大部分是小肽而非游離氨基酸，小肽可完整地被吸收并以二、三肽形式進入血液循環(huán)[3]。小肽作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)對水產(chǎn)動物的促生長效應(yīng)早有研究。研究指出，小肽能促進凡納濱對蝦[4]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[5]和幼建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)[6]等的生長。本試驗在前人研究小肽促凡納濱對蝦生長的基礎(chǔ)上，通過添加不同比例小肽提高飼料蛋白質(zhì)水平的同時，將小肽作為一種免疫增強劑，研究小肽對凡納濱對蝦非特異性免疫力和抗病力的影響，為水產(chǎn)飼料中小肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)與科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料與試驗設(shè)計

基礎(chǔ)飼料以魚粉、豆粕、花生粕等為蛋白質(zhì)源，魚油和磷脂油等為脂肪源，并添加維生素和礦物元素預(yù)混料配制而成。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0(對照)、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和6.0%的小肽，共配制6種試驗飼料，分別命名為S0、S0.5、S1.0、S2.0、S4.0、S6.0。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗所用小肽來源于微生物產(chǎn)酶分解的豆粕蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量≤5 000 u，由深圳裕農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供。各種飼料原料粉碎后過80目篩，按飼料配方準確稱量，微量成分采取逐級擴大法添加，與大宗原料混合均勻后，用雙螺桿制粒機擠壓成1.0和1.5 mm 2種粒徑的顆粒飼料，經(jīng)60 ℃熟化30 min后風干，置于封口袋中封存，于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2 試驗動物與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)進行。

試驗凡納濱對蝦蝦苗購于湛江市中聯(lián)養(yǎng)殖有限公司，購回后在室外水泥池暫養(yǎng)3周。挑選大小均勻、體格健康、初重為(0.19±0.01) g的凡納濱對蝦幼蝦540尾，隨機分成6組，每組設(shè)3個重復，每個重復30尾蝦，以重復為單位飼養(yǎng)于容積為0.3 m3的玻璃纖維桶中，養(yǎng)殖試驗持續(xù)56 d。投喂量按照體重的8%～10%計算，分別于07:00、11:00、17:00、21:00各投喂1次；投喂1 h后觀察攝食情況，根據(jù)天氣、水質(zhì)等情況適當調(diào)整投喂量。試驗初期隔天換水，養(yǎng)殖試驗結(jié)束前2周每天換水，換水量為總水量的1/3～1/2，試驗期間連續(xù)充氧，溶解氧濃度>6.7 mg/L，水溫為28.4～31.2 ℃，鹽度為26～28，pH為7.8～8.2，氨氮濃度<0.03 mg/L。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

續(xù)表1項目Items飼料 DietsS0S0.5S1.0S2.0S4.0S6.0小肽 Small peptides0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 合計Total100.0100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 營養(yǎng)水平 Nutrient levels粗蛋白質(zhì) Crude protein 38.3738.2638.3638.6139.9740.24粗脂肪 Crude lipid7.487.917.908.057.667.76粗灰分 Crude ash9.779.739.799.99.579.74水分 Moisture7.867.77.787.827.667.76

1)每千克維生素預(yù)混料含有Contained the following per kg of vitamin premix：鹽酸硫胺素thiamine hydrochloride 25.50 g，核黃素 riboflavin 25.00 g，鹽酸吡哆醇 pyridoxine hydrochloride 50.00 g，VB120.10 g，VK 5.00 g，VE 99.00 g，維生素A醋酸酯 retinyl acetate 10.00 g，VD 50 g，煙酸 nicotinic acid 101.00 g，D-泛酸鈣D-calcium-pantothenate 61.00 g，生物素 biotin 25.00 g，葉酸 folic acid 6.25 g，肌醇 inositol 153.06 g，纖維素 cellulose 389.09 g。
2)每千克礦物質(zhì)預(yù)混料含有Contained the following per kg of mineral premix：FeC6H5O713.71 g，ZnSO4·7H2O 28.28 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，MnSO4·H2O 12.43 g，CuSO4·5H2O 19.84 g，CoCl2·7H2O 4.07 g，KI 0.03 g，KCl 15.32 g，NaSeO30.02 g，沸石粉 zeolite power 906.18 g。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后禁食24 h，以重復為單位計數(shù)并稱重。每重復隨機選取5尾對蝦，用吸水紙吸干體表水分后置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，用于全蝦常規(guī)營養(yǎng)成分分析。每重復另隨機選取10尾對蝦，用1 mL無菌注射器從圍心腔抽血，將10尾對蝦的血液合并為1個樣本置于1.5 mL的離心管中，4 ℃冰箱靜置過夜，在4 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液分裝后置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于血清非特異性免疫指標的檢測。每重復再隨機選取2～3尾對蝦，取肝胰腺，用濾紙吸干表面水分后準確稱重。按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎肝胰腺，冰水浴制備勻漿，2 500～3 000 r/min，離心10 min，取上清液分裝后置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于肝胰腺非特異性免疫指標的檢測。

1.4 指標測定

1.4.1 飼料及全蝦常規(guī)營養(yǎng)成分分析

參照AOAC(1995)[7]的方法測定飼料及全蝦樣品中水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和總磷含量。采用恒溫烘箱105 ℃烘干至恒重測定水分含量；采用凱氏定氮法(KjeltecTM8400，瑞典)測定粗蛋白質(zhì)含量；采用索氏抽提法(石油醚作為提取溶劑)測定粗脂肪含量；采用550 ℃馬弗爐灰化法測定粗灰分含量；采用比色法測定總磷含量。

1.4.2 血清和肝胰腺中非特異性免疫指標的測定

血清和肝胰腺中溶菌酶(LSZ)活性的測定采用比濁法，超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用WST-1法，丙二醛(MDA)含量的測定采用微板法，酸性磷酸酶(ACP)活性的測定采用微板法，堿性磷酸酶(AKP)活性的測定采用微板法，上述指標均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，試驗步驟按照試劑盒說明書操作。血清中酚氧化物酶(PO)活性測定參照Ashida[8]的方法進行。

1.5 哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒試驗

攻毒試驗所用哈維氏弧菌菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點試驗室提供。養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每個重復隨機選取10尾蝦用于攻毒試驗，通過預(yù)試驗確定哈維氏弧菌對凡納濱對蝦的半致死濃度(LD50)(7 d)為1.96×107CFU/mL，取30 μL此濃度哈維氏弧菌菌液注射于對蝦第2～3腹節(jié)背部。統(tǒng)計對蝦攻毒后7 d的死亡數(shù)量，計算累積死亡率(cumulative mortality rate，CMR)。

1.6 計算公式

存活率(survival rate,SR,%)=100×終末尾數(shù)/初始尾數(shù)；增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(終末均重-初始均重)/初始均重；特定生長率(special growth rate,SGR,%/d)=100×(ln終末均重-ln初始均重)/飼喂天數(shù)；蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)=(終末體重-初始體重)/蛋白質(zhì)攝入量；飼料系數(shù)(feed conversion rate,FCR)=攝食飼料干重/(終末體重-初始體重)；累積死亡率(%)=100×累計死亡尾數(shù)/初始尾數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±SD)表示，使用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間若存在顯著性差異，則再采用Duncan氏法進行多重比較檢驗。以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 小肽對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響

由表2可知，各添加小肽組(S0.5、S1.0、S2.0、S4.0、S6.0組)終末均重顯著高于不添加小肽的對照組(S0組)(P<0.05)；各添加小肽組的增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率均顯著高于對照組(P<0.05)，同時飼料系數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)；各組凡納濱對蝦幼蝦的存活率無顯著差異(P>0.05)。

表2 小肽對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響Table 2 Effects of small peptides on growth performance of juvenile Litopenaeus vannamei (n=3)

同列數(shù)據(jù)肩標不同字母表示顯著差異(P<0.05)。下表同。
Values with different letter superscripts in the same line differ significantly (P<0.05). The same as below.

2.2 小肽對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響

由表3可知，全蝦的水分含量各組之間無顯著差異(P>0.05)；S1.0、S2.0、S4.0和S6.0組全蝦的粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組(P<0.05)，S0.5組與對照組無顯著差異(P>0.05)；S2.0和S4.0組全蝦粗脂肪含量與對照組差異不顯著(P>0.05)，但S0.5、S1.0和S6.0組顯著高于對照組(P<0.05)；S0.5組全蝦粗灰分含量顯著低于對照組(P<0.05)，S2.0、S4.0和S6.0組顯著高于對照組(P<0.05)，S1.0與對照組無顯著差異(P>0.05)；S0.5和S4.0組全蝦的總磷含量顯著低于對照組(P<0.05)，其他組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表3 小肽對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of small peptides on body composition of juvenile Litopenaeus vannamei (DM basis) (n=3) %

2.3 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清非特異性免疫指標的影響

由表4可知，LSZ活性各組之間無顯著差異(P>0.05)；隨著小肽添加量的增加，PO活性呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，以S2.0組最高，S2.0組次之，二者顯著高于其他組(P<0.05)；S0.5和S1.0組SOD活性顯著高于對照組和S4.0組(P<0.05)，S0.5組還顯著高于S2.0組(P<0.05)，其余各組間無顯著差異(P>0.05)；S1.0和S2.0組ACP活性顯著高于其他組(P<0.05)；AKP活性各組之間無顯著差異(P>0.05)，但各添加小肽組在數(shù)值上均高于對照組；S4.0和S6.0組MDA含量顯著低于其他組(P<0.05)，S4.0組顯著低于S6.0組(P<0.05)。

表4 小肽對凡納濱對蝦幼蝦血清非特異性免疫指標的影響Table 4 Effects of small peptides on serum non-specific immune indexes of juvenile Litopenaeus vannamei (n=3)

2.4 小肽對凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺非特異性免疫指標的影響

由表5可知，LSZ活性，S0.5、S2.0和S4.0組顯著高于對照組(P<0.05)，S6.0組則顯著低于對照組(P<0.05)；SOD活性，各組間無顯著差異(P>0.05)；ACP活性，各小肽添加組與對照組無顯著差異(P>0.05)，但S0.5和S1.0組顯著高于S2.0和S4.0組(P<0.05)；AKP活性，S4.0組顯著低于對照組(P<0.05)，其余各組之間無顯著差異(P>0.05)；MDA含量，各小肽添加組均顯著低于對照組(P<0.05)，同時S4.0組還顯著低于S6.0組(P<0.05)。

表5 小肽對凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺非特異性免疫指標的影響Table 5 Effects of small peptides on hepatopancreas non-specific immune indexes of juvenile Litopenaeus vannamei (n=3)

2.5 小肽對凡納濱對蝦幼蝦哈維氏弧菌攻毒后累積死亡率的影響

凡納濱對蝦幼蝦經(jīng)哈維氏弧菌攻毒后累積死亡率的變化趨勢如圖1所示。圖2顯示，小肽添加量為0.5%、1.0%、2.0%和4.0%時，凡納濱對蝦幼蝦哈維氏弧菌攻毒后7 d的累積死亡率顯著低于對照組(P<0.05)；小肽添加量為6.0%時，凡納濱對蝦幼蝦哈維氏弧菌攻毒后7 d的累積死亡率與對照組無顯著差異(P>0.05)。

圖1 小肽對凡納濱對蝦幼蝦哈維氏弧菌攻毒后累積死亡率的影響Fig.1 Effects of small peptides on CMR of juvenile Litopenaeus vannamei after challenged by Vibrio harveyi

數(shù)據(jù)柱標注不同字母表示顯著差異(P<0.05)。
Value columns with different letters differ significantly (P<0.05).
圖2凡納濱對蝦幼蝦哈維氏弧菌攻毒后7d的累積死亡率
Fig.2 CMR of 7 days for juvenileLitopenaeusvannameiafter challenged byVibrioharveyi

3 討 論

3.1 小肽對凡納濱對蝦幼蝦生長和體成分的影響

小肽由2個以上氨基酸組成，有些是天然的，有些則是由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生。小肽作為蛋白質(zhì)主要消化產(chǎn)物，在氨基酸的消化、吸收及動物營養(yǎng)代謝中起重要作用。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，飼料中適當添加小肽能夠增強水產(chǎn)動物的免疫力，提高存活率和增重率以及飼料利用率。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加小肽能夠促進凡納濱對蝦幼蝦生長，這一試驗結(jié)果與林啟存等[4]的研究結(jié)果一致。另外，Tetshima等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小肽對對蝦幼苗具有顯著的促生長作用。于輝等[10]、馮健等[5]在對草魚的研究中發(fā)現(xiàn)小肽能夠提高飼料的消化率，具有促生長作用。同樣，在幼建鯉[6]和歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[11]的研究中也發(fā)現(xiàn)小肽具有促生長作用。

小肽與游離氨基酸都是蛋白質(zhì)酶解后得到的產(chǎn)物，但是兩者的吸收存在著2種相互獨立的轉(zhuǎn)運機制[12]。游離氨基酸的吸收是由腸細胞主動轉(zhuǎn)運，是逆濃度轉(zhuǎn)運，通過不同的鈉離子(Na+)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進行[13]。小肽則是不經(jīng)過降解直接被腸壁吸收轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán)。腸道黏膜上有小肽的轉(zhuǎn)運載體，與游離氨基酸的吸收相比，小肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運速度快、耗能低、不易飽和的特點[14]。研究表明，小肽被直接吸收后，能夠參與機體的生理活動和代謝調(diào)節(jié)，提高蛋白質(zhì)沉積，從而促進機體的生長性能。

本試驗結(jié)果顯示，飼料中添加小肽可顯著影響凡納濱對蝦幼蝦全蝦的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和總磷含量，但對水分含量無顯著影響。關(guān)于添加小肽對機體成分的影響，在魚類中有相關(guān)的報道，其中，對西伯利亞鱘(AcipenserbaeriiBrandt)的研究發(fā)現(xiàn)，小肽替代飼料中魚粉對全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量無顯著影響[15]，在對異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[16]的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)，與本試驗結(jié)果存在差異，這可能是由于不同種類的水產(chǎn)動物，小肽所產(chǎn)生的體成分的沉積能力有差異所致。

3.2 小肽對凡納濱對蝦幼蝦非特異性免疫力及抗病力的影響

小肽是一類分子質(zhì)量較小、結(jié)構(gòu)較為松散的具有多種生物功能的生物肽。這些由蛋白質(zhì)水解所產(chǎn)生的小肽具有一定的免疫功能。因此小肽是一種重要的免疫增強劑，添加小肽能夠提高水產(chǎn)動物的非特異性免疫酶活性。

LSZ作為對蝦非特異性免疫因子，參與機體多種免疫反應(yīng)，能改善和增強巨噬細胞吞噬能力和消化功能，從一定程度上提高對蝦的生長率和存活率[17]。本試驗結(jié)果表明，各添加小肽組血清中LSZ活性與對照組相比雖然無顯著差異，但在數(shù)值上均高于對照組；飼料中添加0.5%～4.0%的小肽顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺中LSZ活性。許培玉等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1.5%的小肽可提高凡納濱對蝦肌肉和頭部LSZ活性。

SOD是機體清除氧自由基的重要酶系[18]，對機體的氧化和抗氧化平衡起重要作用[19-20]，其活性高低可間接反映機體清除氧自由基的能力。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加0.5%～1.0%的小肽可顯著提高凡納濱對蝦幼蝦血清中SOD活性，但對肝胰腺中SOD活性則無顯著影響。

PO是一種反映機體免疫狀態(tài)的具有異物識別作用的防御酶，在甲殼動物體內(nèi)以酶原的形式存在，外來病原入侵和環(huán)境脅迫時酶原激活進行免疫識別與防疫[21]。本試驗中，血清中PO活性隨著小肽添加量的增加呈現(xiàn)出先上升在下降的趨勢，S1.0和S2.0組顯著高于其他組。王秀華等[22]研究表明，通過添加小肽類制劑對凡納濱對蝦體液免疫能產(chǎn)生影響，可顯著提高對蝦血清中PO活性，本試驗結(jié)果與該研究結(jié)果相似。

ACP和AKP是凡納濱對蝦體內(nèi)重要的具有免疫功能的酶，可直接殺死侵入病原，并且可以將其進一步水解消化，在機體免疫系統(tǒng)抵御病原的免疫反應(yīng)中起重要作用[22]。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加1.0%～2.0%的小肽能夠提高凡納濱對蝦幼蝦血清中ACP活性。

MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[23-24]，其會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。因此，降低MDA含量即減少了細胞的受損程度。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加小肽能夠降低凡納濱對蝦幼蝦血清和肝胰腺中MDA的含量，這可能是由于添加小肽能夠?qū)毎鸬奖Ｗo作用，從而提高對蝦的生長性能和攻毒后的存活率。研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加谷胱甘肽能降低凡納濱對蝦肝胰腺中MDA的含量[18]。另外，王際英等[25]對星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚的研究表明，飼料中添加適量小肽能有效提高消化道中消化酶活性。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加小肽能降低赤點石斑魚(Epinephelusakaara)的蛋白質(zhì)需求量，促進脂肪代謝，提高消化道中消化酶活性[26]。

人工攻毒是評估對蝦非特異性免疫力和抗病力的有效方法[27]。哈維氏弧菌是一種在海洋環(huán)境中廣泛存在的革蘭氏陰性發(fā)光細菌，會致使凡納濱對蝦患發(fā)光病、肝胰腺細胞壞死，最終導致死亡[28]。本試驗采用哈維氏弧菌對凡納濱對蝦幼蝦進行攻毒試驗，結(jié)果顯示，小肽添加量為0.5%～4.0%時凡納濱對蝦幼蝦在攻毒7 d后的累積死亡率顯著降低?？梢?，飼料中添加適量小肽有利于提高凡納濱對蝦的非特異性免疫力和抗病力，這與林啟存等[4]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

飼料中添加1.0%～2.0%的小肽可促進凡納濱對蝦幼蝦生長，提高其非特異性免疫力和抗病力。