彭芳 ，王志 ，王建 ，張功亮 ，鐘斌

(1、贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000；2、贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 341000)

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，其中有部分結(jié)直腸癌是由于錯(cuò)配修復(fù)基因突變型失活或錯(cuò)配修復(fù)基因甲基化失活[1－7]， 導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）， 從 而 導(dǎo) 致 錯(cuò) 配 修 復(fù) 蛋 白 MLH1，PMS2，MSH2及MSH6表達(dá)異常。有研究表明P16蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8－13]，P16蛋白表達(dá)是結(jié)直腸癌患者診斷及預(yù)后的候選標(biāo)志物。以免疫組化的檢查方法檢查結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6以及 P16蛋白的表達(dá)情況，并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析其在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1．1 病例資料 收集本院2016年1月至2017年10月間原發(fā)于結(jié)直腸腺癌共60例。其中男性35例，女性25例，年齡28～79歲，平均年齡50歲。腫瘤平均最大徑4．6cm，31例呈浸潤潰瘍型，20例呈隆起菜花型，5例呈平坦型，4例呈淺表潰瘍型。腫物切面呈實(shí)性，灰白灰紅色，質(zhì)中偏硬，灶性區(qū)域伴出血壞死。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料 免疫組化SP法檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1．3 免疫組織化學(xué)方法 免疫組織化學(xué)試劑一抗福建邁新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的MLH1，PMS2，MSH2及MSH6多克隆抗體。檢測系統(tǒng)采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚3微米，60度烤箱烤片1h，二甲苯脫蠟，乙醇水化，浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min，PBS液沖洗，高壓鍋修復(fù)，并自然冷卻。二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育 20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑 B，孵育 30min，PBS沖洗 3次，每次5min。控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，返藍(lán)、脫水、透明、中性樹膠封片，并做陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1．4 免疫組織化學(xué)判斷的標(biāo)準(zhǔn) 定位準(zhǔn)確，呈棕黃色顆粒為陽性，I陽性定位于細(xì)胞漿/膜或細(xì)胞核，陽性細(xì)胞小于10%為 （－），陽性細(xì)胞11－25%為（+），陽性細(xì)胞 26－50%為（++），陽性細(xì)胞 51－75%為（+++），陽性細(xì)胞 76－100%為（++++）。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P＜0．05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸腺癌中MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6蛋白的表達(dá)情況：MMR蛋白的表達(dá)缺失率分別為：MLH1缺失率 28．5%，PMS2 缺 失率 25．2%，MSH2 缺 失 率 27．2%，MSH6缺失率27．3%；正常組織中的缺失率分別為：MLH1缺失率 2．5%，PMS2 缺 失 率 3．2%，MSH2 缺 失 率2．2%，MSH6 缺失率 1．9%。 差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，腫瘤組織中MMR蛋白的表達(dá)缺失率表達(dá)遠(yuǎn)高于正常組織。見圖1。

2．2 免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸腺癌中P16蛋白的表達(dá)情況：P16蛋白在結(jié)直腸腺癌的表達(dá)率為78．3%（47/60）。 高、中分化腺癌中 P16蛋白的表達(dá)率為88．3%(53/60），低分化腺癌中P16蛋白的表達(dá)率為 15%（9/60）， 差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0．05)，高、中分化腺癌中P16蛋白表達(dá)遠(yuǎn)高于低分化腺癌。見圖2。

圖1 MLH1蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果（×400）

圖2 P16蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果（×200）

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國男、女性惡性腫瘤發(fā)病率排名中分別列第三位、第二位[1－3]，嚴(yán)重危害人類健康。研究結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子遺傳學(xué)機(jī)制，尋找和利用有效的早期診斷、分期、分型以及預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物，提高結(jié)直腸癌的預(yù)防、診斷和治療水平，對(duì)降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率有著重要的意義。

近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年上升，其中有部分結(jié)直腸癌是由于錯(cuò)配修復(fù)基因突變型失活或錯(cuò)配修復(fù)基因甲基化失活[4－7]，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)蛋白 MLH1，PMS2，MSH2及MSH6表達(dá)異常。有研究表明P16蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8－15]，P16蛋白表達(dá)是結(jié)直腸癌患者診斷及預(yù)后的候選標(biāo)志物。本研究以免疫組化的檢查方法檢查結(jié)直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6以及 P16蛋白的表達(dá)情況，我們的研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中，MMR基因缺失是導(dǎo)致 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6蛋白表達(dá)率降低。高、中分化腺癌中P16蛋白表達(dá)遠(yuǎn)高于低分化腺癌，提示P16蛋白可能與結(jié)直腸癌的高侵襲性有關(guān)。