分散固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定沉積物中氟喹諾酮類藥物殘留

錢卓真，梁 焱，王麗娟，湯水粉，羅方方，陳 思

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013； 2.海南省環(huán)境科學(xué)研究院，海南 ?？?570026)

氟喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜類抗生素藥物，被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖及醫(yī)藥行業(yè)。由于該類藥物的大量及不恰當使用，大量藥物被直接排入環(huán)境中，或通過人體、動物以間接方式進入環(huán)境[1-2]。據(jù)文獻報道，氟喹諾酮類藥物不僅在動物源性食品中廣泛被檢出，而且在環(huán)境水體[3-5]、沉積物[6-8]、土壤[9]中也普遍被檢出。該類藥物在沉積物和土壤中性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長，不易降解[10-11]，可對環(huán)境造成直接污染。且該藥物還可能對土壤和沉積物中微生物的耐藥性產(chǎn)生壓力，誘導(dǎo)抗生素抗性基因和耐藥性細菌的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生嚴重的生態(tài)毒性[12-13]。因而氟喹諾酮類藥物引起的環(huán)境污染問題已成為近年來國內(nèi)外的研究熱點[14]。

目前已報道的檢測方法有電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光偏振免疫分析法等。其中，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，已成為氟喹諾酮類藥物殘留測定的主要檢測方法。與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合的傳統(tǒng)凈化方法主要是固相萃取法，但其步驟繁瑣、耗時，費用較高。雖然近幾年基于固相萃取法衍生出一系列新的凈化方法，如磁性氧化石墨烯固相萃取法[15]、分子印跡固相萃取法[16]等，但整體研究難度仍偏大。2003年美國農(nóng)業(yè)部提出了一種快速、簡單、成本低廉的新型分散固相萃取凈化技術(shù)。該技術(shù)問世以來，已經(jīng)成為了全球檢測水果、蔬菜中農(nóng)殘的標準樣品處理方法，近年來也涉及到越來越多的不同領(lǐng)域，比如肉類、血液、酒，但應(yīng)用于沉積物中氟喹諾酮類藥物殘留測定的研究鮮有報道。

本研究考察了不同吸附劑凈化效果，將優(yōu)化后的分散固相萃取法應(yīng)用于沉積物樣品的前處理，擬建立沉積物中5種典型氟喹諾酮類藥物同時被測定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，將為沉積物樣品中氟喹諾酮類藥物多殘留量痕量快速檢測和判斷沉積物中氟喹諾酮類藥物污染提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)、沙拉沙星(Sarafloxacin，SAR)、氟羅沙星(Fleroxacin，F(xiàn)LE)購自Dr.Ehrensorfer公司(純度>95%)；氘代諾氟沙星(Norfloxacin-D5，NOR-D5)、氘代環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin-D8，CIP-D8)、氘代恩諾沙星(Enrofloxacin-D5，ENR-D5)購自Witega公司(純度>99%)。上述標準品用甲醇配制成100 μg/mL的標準儲備液，于-18℃下避光保存，有效期為6個月；用甲醇配制成NOR、CIP、ENR、SAR、FLE的1 μg/mL混合標準溶液，于4℃下避光保存，有效期為1個月；用甲醇配制成NOR-D5、CIP-D8、ENR-D5的1 μg/mL混合標準溶液，于4℃下避光保存，有效期為1個月。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，購自美國Tidea公司；乙酸銨、磷酸(H3PO4)、二水合磷酸二氫鉀(KH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、氯化鈉(NaCl)為化學(xué)純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂(MgSO4)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18均購置天津博納艾杰爾科技有限公司；0.22 μm尼龍微孔濾膜購自天津市津騰實驗設(shè)備有限公司。磷酸鹽緩沖溶液：2.72 g KH2PO4·2H2O與0.13 mL H3PO4，用超純水定容至100 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ QUANTUM ULTRA 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Thermo-Fisher Scientific公司；AB204-E型、PL203型電子分析天平：Mettler Toledo公司；DT5-5型低速臺式離心機、GT16-3高速臺式離心機：北京時代北利離心機有限公司；TDL-80-2B低速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；MS3型旋渦混合器：德國IKA公司；ZZDCH16水浴氮吹儀：廣州智真生物科技有限公司；KQ3200E超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司； Milli-Q型超純水儀：美國Millipore公司。

1.3 儀器分析條件

色譜柱：Ultimate XB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；柱溫：40℃；流動相A：4 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，流動相B：0.1%甲酸甲醇；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表1。電噴霧電離(ESI)正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，噴霧電壓3 500 V，鞘氣壓力55 Arb，輔助氣壓力15 Arb，離子傳輸管溫度320℃，霧化室加熱溫度220℃，碰撞氣1.5 mtorr；母離子、子離子和碰撞能量見表2；Q1半峰寬為0.7 Da，Q3半峰寬為0.7 Da。

表1 梯度洗脫程序

表2 氟喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)

注：*表示定量離子。

Note：*indicated quantitative ion.

1.4 樣品前處理

稱取(2.00±0.02)g試樣于50 mL塑料離心管中，加入0.15 g Na2EDTA、20 mL乙腈-磷酸鹽(1∶1，V/V)緩沖液，NOR-D5、CIP-D8、ENR-D5內(nèi)標各50 ng，渦旋1 min，超聲5 min，劇烈手搖2 min，再加入2 g NaCl繼續(xù)手搖1 min，4 000 r/min離心5 min；移取7～8 mL上清液于15 mL含有分散固相萃取材料(0.25g MgSO4、0.05 g C18、0.12 g PSA、0.01 g GCB)的離心管中，渦旋1 min，手搖1 min，3 000 r/min離心3 min，移取5 mL上清液，50℃氮吹至干。加入流動相溶液(流動相A∶流動相B=7∶3，V/V)0.5 mL超聲溶解，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟喹諾酮類藥物具有兩性基團，屬于酸堿兩性化合物，在水溶液中通常以離子形式存在，易與色譜柱內(nèi)硅膠殘留的硅醇基作用，從而造成色譜峰拖尾、峰形異常和保留值不穩(wěn)定。試驗比較了不同品牌的色譜柱，最終選擇了端基封尾較好的Ultimate XB-C18色譜柱。同時嘗試了乙腈、甲酸、乙酸銨之間多種配比的流動相條件，經(jīng)過多次比較優(yōu)化，本試驗采用含4 mmol/L乙酸銨的0.1 %甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇溶液，采用梯度洗脫程序，諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氟羅沙星在10 min內(nèi)被洗脫且分離良好，峰型尖銳對稱。

用注射針吸1 μg/mL氟喹諾酮類藥物混合標準溶液通過蠕動泵以5 μL/min的速度直接注入離子源，在正離子掃描方式下，分別進行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)、二級質(zhì)譜分析(Q3掃描)和多反應(yīng)監(jiān)測分析，接著分別再對碰撞氣能量、電噴霧電壓、鞘氣壓力、輔氣壓力、離子源溫度、霧化室溫度進行優(yōu)化，使每種藥物的分子離子與特征碎片離子(子離子)產(chǎn)生的離子對信號強度達到最大，從中選擇每種藥物的監(jiān)測子離子對。LC/MS/MS標準品色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取

提取溶液仍選用常用的土壤抗生素提取溶液——磷酸鹽緩沖溶液與乙腈混合溶液。試驗采用超聲波輔助提取法[17]，主要是利用超聲波的空化、機械及熱效應(yīng)等來增強提取溶液分子的運動速度及穿透力，從而提高氟喹諾酮類藥物的提取效率。且考察了1、2、5、7 min超聲提取時間對氟喹諾酮類藥物的提取效果。結(jié)果表明，隨著提取液與目標物超聲接觸時間的延長，目標物提取效率隨之增大。當超聲時間增至5 min時，目標物平均回收率達到67.9%～112%。而當超聲時間延長至7 min時，目標物回收率無受影響。為了保證提取效率，同時減少雜質(zhì)干擾，試驗最終選擇5 min作為超聲提取時間。試驗中加入NaCl，有助于提取液的乙腈層和水層分開。

2.2.2 樣品凈化

沉積物樣品中存在脂肪、色素、甾醇等雜質(zhì)，因而分散固相萃取法的關(guān)鍵是吸附劑的選擇，既能有效除去沉積物中雜質(zhì)，又不會吸附目標物。常見的分散固相萃取法的吸附材料有MgSO4、PSA、C18、GCB等。作為傳統(tǒng)干燥劑，MgSO4用于去除有機溶劑殘留的水，且吸水放熱的過程可促進目標物的溶出[18]。PSA含有兩個氨基，可有效吸附糖類、色素、脂肪酸和其他極性有機酸[19-21]。C18含有十八烷基官能團，屬于非極性吸附劑，可以吸附脂肪和一些礦物質(zhì)[22]。GCB保留特殊的層狀結(jié)構(gòu)，能夠吸附色素、甾醇等雜質(zhì)[23]。為了選擇合適的吸附劑，試驗考察了4種吸附劑量對目標物氟喹諾酮類藥物回收率的影響，設(shè)計了4個水平：MgSO4(1.00、0.75、0.50、0.25 g)，PSA(0.20、0.15、0.12、0.10 g)，C18(0.15、0.10、0.05、0 g)，GCB(0.04、0.02、0.01、0 g)，見圖2～圖5。試驗結(jié)果表明，添加濃度為25 μg/kg水平下，單獨采用PSA、C18凈化，凈化效果不佳；因而選用MgSO4、PSA、C18、GCB作為混合凈化吸附劑。隨著PSA用量的增加，回收率降低(圖2)；隨著C18用量的增加，回收率先升高隨后降低(圖3)；隨著MgSO4用量的增加，回收率急劇降低(圖4)；在保證回收率的基礎(chǔ)上，少量GCB的加入，可有效除去提取液中的色素(圖5)。經(jīng)優(yōu)化，綜合考慮凈化效果和方法回收率，最終確定0.25 g MgSO4、0.12 g PSA、0.05 g C18、0.01 g GCB作為凈化吸附劑。

2.3 標準曲線、線性范圍、檢出限和定量限

在電噴霧有機質(zhì)譜電離條件下，沉積物樣品提取液具有明顯的基質(zhì)增強效應(yīng)，這主要來源于沉積物樣品中脂肪、色素、甾醇等雜質(zhì)。為了消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的定量偏差[24]，試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線法，移取適量混合標準溶液，用空白沉積物樣品提取液分別配制成不同質(zhì)量濃度基質(zhì)標準溶液，目標物濃度分別為2.5、5、10、50、100和200 ng/mL，內(nèi)標的質(zhì)量濃度均為100 ng/mL。以各目標物質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，各目標物與同位素內(nèi)標峰面積比為縱坐標(Y)建立標準曲線，各組分濃度與其色譜峰面積比呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以10倍信噪比(S/N)計算定量限，具體數(shù)值見表3。

2.4 方法準確度和精密度

以實際采集的養(yǎng)殖區(qū)泥質(zhì)為研究對象，進行標準添加試驗，分別以低、中、高三個添加水平進行加標回收試驗，每個濃度水平做5個平行試驗，考察方法的準確度及精密度。如表3所示，平均回收率在79.8%～112%，相對標準偏差3.2%～9.9%。30 d內(nèi)25 μg/kg加標濃度下進行6次標準添加試驗，考察方法日間精密度，相對標準偏差5.3%～8.6%(表3)。方法的精密度和準確度均能滿足藥物殘留監(jiān)測需求。選取3種類型的的沉積物——泥質(zhì)、泥沙、沙質(zhì)為檢測對象，25 μg/kg加標濃度下考察方法適用性，回收率為87.1%～101%，相對標準偏差為3.2%～9.0%(表4)。該方法適用范圍廣。

表3 方法準確度和精密度測定結(jié)果

表4 不同類型的沉積物樣品加標回收率(n=5)

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測沉積物中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氟羅沙星殘留的分析方法，并對色譜條件、質(zhì)譜條件、樣品提取凈化方法進行了優(yōu)化，方法簡單、快速、靈敏度高，準確度、精密度和各項技術(shù)指標均滿足國內(nèi)外殘留檢測的相關(guān)要求。且該方法實用性強，適用于大批量樣品的測定，可作為沉積物樣品中氟喹諾酮類藥物多殘留量痕量快速檢測的方法，并為沉積物中氟喹諾酮類藥物污染的判定提供技術(shù)支持。