黃冬麗，王福彬，吳柳芬

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

小球藻 （Chlorella spp） 為綠藻門 （Chlorop Hyta） 小球藻屬（Chlorella） 球形單細(xì)胞淡水藻類，是地球上最早的生命之一，其細(xì)胞內(nèi)光合作用色素豐富，因此具有較強(qiáng)的光合作用生產(chǎn)能力[1]。已有研究表明，小球藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、色素、維生素、礦物質(zhì)等，被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)療保健、環(huán)境保護(hù)、基因工程等行業(yè)，一直以來都是研究熱點(diǎn)。胡月薇[2]在研究中發(fā)現(xiàn)蛋白核小球藻粉對(duì)小鼠吞噬細(xì)胞活性有重要影響；紀(jì)雁[3]在研究中發(fā)現(xiàn)小球藻通過光合作用在味精廢水處理中發(fā)揮重要功能；魏文志[4]在研究中發(fā)現(xiàn)小球藻蛋白在預(yù)防腫瘤中發(fā)揮重要作用。

多種環(huán)境因素，如光照強(qiáng)度、溫度、pH值、CO2體積分?jǐn)?shù)、氮源質(zhì)量濃度等都能對(duì)小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，其中光照強(qiáng)度、氮源質(zhì)量濃度和CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)小球藻生長(zhǎng)起著尤為重要的作用[5-6]。光照強(qiáng)度和CO2體積分?jǐn)?shù)主要影響小球藻的光合作用，而氮源主要影響小球藻生物量的積累[2]。試驗(yàn)通過設(shè)置不同梯度的光照強(qiáng)度、氮源質(zhì)量濃度和CO2體積分?jǐn)?shù)，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出藻細(xì)胞干質(zhì)量，通過藻細(xì)胞干質(zhì)量的積累量對(duì)小球藻的生長(zhǎng)效果進(jìn)行評(píng)估，以期為小球藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要材料與試劑

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，所選用的培養(yǎng)基是經(jīng)過改良的f/2培養(yǎng)基。

f/2培養(yǎng)基的配方：CH4N2O（尿素） 0.5 g/L，K2HPO40.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.036g/L，Na2CO30.02g/L，EDTA0.001g/L，C6H8FeNO7（檸檬酸鐵銨） 0.006 g/L，微量元素A5溶液1 mL，pH值7.5。

A5 溶液：H3BO42.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.81 g/L，ZnSO40.222 g/L， Na2MoO40.39 g/L， CuSO4·5H2O 0.079 g/L，CO（NO3）2·6H2O 0.049 g/L，所有試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

YXQ-LS-100SII-01-00型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品；GEN10S型紫外可見分光光度計(jì)，賽摩飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；AR224CN型電子天平，常州奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；DG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TES 1332A型照度計(jì)（中國(guó)臺(tái)灣）；MD-SYJ型照明設(shè)備，中山市歐普照明有限公司產(chǎn)品；氣體質(zhì)量流量計(jì)，北京首科實(shí)華自動(dòng)化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

根據(jù)培養(yǎng)基的配方準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)藥品，先配制成母液，待試驗(yàn)時(shí)將母液混合稀釋后經(jīng)高壓滅菌即可制成微藻培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度25±1℃，光暗周期12 h/12 h，CO2體積分?jǐn)?shù)用氣體流量計(jì)控制。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取指數(shù)生長(zhǎng)末期的藻液1 L，稀釋至5個(gè)不同質(zhì)量濃度后于波長(zhǎng)680 nm處測(cè)OD值，然后將每個(gè)質(zhì)量濃度的樣品平均分成3份，用真空抽濾泵將其抽濾到玻璃纖維膜上，然后放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中于105℃條件下烘干至恒質(zhì)量。稱質(zhì)量后減去玻璃纖維膜的質(zhì)量即得樣品干質(zhì)量。取3份樣品的平均值即為該質(zhì)量濃度下樣品的干質(zhì)量，并結(jié)合樣品體積，計(jì)算其細(xì)胞干質(zhì)量（mg/mL）。以O(shè)D680為X軸、藻細(xì)胞干質(zhì)量為Y軸，繪制藻細(xì)胞干質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（1）小球藻細(xì)胞干質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白核小球藻細(xì)胞干質(zhì)量-OD680標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在培養(yǎng)溫度25℃，CO2體積分?jǐn)?shù)15%，氮源質(zhì)量濃度0.5 g/L的條件下，只改變光照強(qiáng)度為2.5×103，5.0×103，7.5×103lx，對(duì)小球藻進(jìn)行光照培養(yǎng)。每隔24 h對(duì)小球藻進(jìn)行取樣測(cè)吸光度并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其細(xì)胞干質(zhì)量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響見圖2。

圖2 光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在光照強(qiáng)度為5×103lx時(shí)，小球藻的細(xì)胞干質(zhì)量積累量最高。由圖2可知，在小球藻生長(zhǎng)前期，光照強(qiáng)度對(duì)小球藻干質(zhì)量的積累影響不明顯，不同強(qiáng)度光照下的小球藻細(xì)胞干質(zhì)量差距不明顯；隨著細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量的積累的影響顯著增加，不同強(qiáng)度光照下的小球藻細(xì)胞干質(zhì)量差距明顯拉大[8]。對(duì)比圖2中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，小球藻在光照強(qiáng)度為7.5×103lx時(shí)的生長(zhǎng)狀況沒有光照強(qiáng)度為5.0×103lx時(shí)好，表明過強(qiáng)的光照反而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)。

2.2 CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度5.0×103lx，氮源質(zhì)量濃度0.5 g/L的條件下，通過氣體流量計(jì)控制CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，10%，15%，20%，對(duì)小球藻進(jìn)行光照培養(yǎng)。每隔24 h對(duì)小球藻進(jìn)行取樣測(cè)吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其細(xì)胞干質(zhì)量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響見圖3。

圖3 CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在CO2體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，小球藻的細(xì)胞干質(zhì)量積累量最高。由圖3可知，4種不同體積分?jǐn)?shù)的CO2條件下，CO2體積分?jǐn)?shù)15%時(shí)生長(zhǎng)的小球藻干物質(zhì)積累量顯著高于其他3種。初始3 d內(nèi)，4種培養(yǎng)條件下的小球藻干質(zhì)量積累增長(zhǎng)較慢，此時(shí)小球藻可能處于潛伏生長(zhǎng)期[9]。在4～6 d時(shí)，小球藻生長(zhǎng)旺盛，干質(zhì)量迅速積累，CO2體積分?jǐn)?shù)15%培養(yǎng)條件下的小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累量明顯高于其他3種。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到20%，小球藻在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞干質(zhì)量積累量明顯低于其他3種，說明CO2體積分?jǐn)?shù)過高反而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)。

2.3 氮源質(zhì)量濃度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在控制培養(yǎng)溫度為25℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為15%，光照強(qiáng)度為5.0×103lx，只改變氮源質(zhì)量濃度為0.5，1.0，1.5 g/L，對(duì)小球藻進(jìn)行光照培養(yǎng)。每隔24 h對(duì)小球藻進(jìn)行取樣測(cè)吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其細(xì)胞干質(zhì)量，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

氮源質(zhì)量濃度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響見圖4。

圖4 氮源質(zhì)量濃度對(duì)小球藻細(xì)胞干質(zhì)量積累的影響

在氮源質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，小球藻的細(xì)胞干質(zhì)量積累量最高。由圖4可知，隨著氮源質(zhì)量濃度的升高，小球藻的細(xì)胞干質(zhì)量的積累逐漸減少，這表明氮源質(zhì)量濃度過高不利于小球藻的生長(zhǎng)。在初始的3 d內(nèi)，3種氮源質(zhì)量濃度下的小球藻細(xì)胞干質(zhì)量相差不大，說明氮源濃度對(duì)處于潛伏生長(zhǎng)期的小球藻干重積累影響不大[10]；在4～6 d時(shí)，小球藻進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)需要合成大量蛋白質(zhì)，故此時(shí)氮源質(zhì)量濃度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)影響較大，在氮源質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)的小球藻干質(zhì)量積累量要明顯高于其他2種條件。

3 討論

光照強(qiáng)度、氮源質(zhì)量濃度和CO2體積分?jǐn)?shù)對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有重要影響。其中光照強(qiáng)度和CO2體積分?jǐn)?shù)主要影響小球藻的光合作用，而氮源質(zhì)量濃度主要影響小球藻蛋白質(zhì)的合成，這些因素的改變都會(huì)引起細(xì)胞干質(zhì)量發(fā)生變化，因此研究利用細(xì)胞干質(zhì)量的變化來反映小球藻的生長(zhǎng)狀況。

光照不僅是小球藻光合作用所必須的條件，而且調(diào)節(jié)小球藻的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程，以便小球藻能更好地適應(yīng)外界環(huán)境。光照強(qiáng)度通過影響小球藻對(duì)無機(jī)碳的親和力間接對(duì)小球藻的生長(zhǎng)發(fā)揮作用，而藻類細(xì)胞中無機(jī)碳的積累和運(yùn)輸都需要能量的驅(qū)動(dòng)，能量的來源與光系統(tǒng)Ⅰ中的電子流密切相關(guān)。研究中通過對(duì)光照條件的控制，來探討光照強(qiáng)度對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在一定的范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)卦黾庸庹諒?qiáng)度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；但當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到最適值5.0×103lx后，再增加光照強(qiáng)度，反而會(huì)引起小球藻細(xì)胞內(nèi)無機(jī)碳的相對(duì)耗竭，從而抑制微藻的生長(zhǎng)[10]。

CO2參與小球藻的光合作用過程，通過碳同化途徑變成有機(jī)物，從而使小球藻細(xì)胞干質(zhì)量增加。CO2體積分?jǐn)?shù)主要通過影響小球藻光合作用過程CO2濃縮機(jī)制中對(duì)無機(jī)碳的利用間接影響小球藻生長(zhǎng)發(fā)育。研究中通過控制CO2的體積分?jǐn)?shù)來對(duì)小球藻的生長(zhǎng)條件進(jìn)行探討。結(jié)果表明，在合適的范圍內(nèi)，適當(dāng)增加CO2體積分?jǐn)?shù)有利于小球藻生物量的積累，導(dǎo)致藻細(xì)胞干質(zhì)量明顯增加；但是當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最適值15%時(shí)，再提高CO2體積分?jǐn)?shù)反而會(huì)導(dǎo)致小球藻對(duì)無機(jī)碳的親和力下降，對(duì)小球藻的生長(zhǎng)不利[12]。

氮源是小球藻蛋白質(zhì)合成過程中的重要原料，不同質(zhì)量濃度的氮源會(huì)影響小球藻的蛋白質(zhì)合成，間接影響小球藻的生長(zhǎng)發(fā)育。研究中選用尿素作為氮源，通過控制尿素的質(zhì)量濃度來對(duì)小球藻的生長(zhǎng)條件進(jìn)行探討。結(jié)果表明，在3種氮源培養(yǎng)條件下，氮源質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)最利于小球藻生物量的積累，而高質(zhì)量濃度的氮源會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值升高，從而會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)[13]。

4 結(jié)論

在小球藻的培養(yǎng)過程中，光照強(qiáng)度5.0×103lx，CO2體積分?jǐn)?shù)15%，氮源質(zhì)量濃度0.5 g/L時(shí)有利于促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)和對(duì)無機(jī)碳的利用，使小球藻細(xì)胞干質(zhì)量的積累量增加。研究通過對(duì)不同培養(yǎng)條件下小球藻細(xì)胞干質(zhì)量的測(cè)量，從而對(duì)小球藻的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行評(píng)估，并從中選出合適的光照強(qiáng)度、CO2體積分?jǐn)?shù)和氮源質(zhì)量濃度，以期為今后小球藻培養(yǎng)條件優(yōu)化的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

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