高強(qiáng)度超聲對鵝胸肉嫩度及品質(zhì)的影響

張 坤，王道營，張 淼，諸永志，鄒 燁,*，徐為民,3,*

（1.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

我國有悠久的養(yǎng)鵝歷史，是世界上養(yǎng)鵝數(shù)量最多、品種最豐富的國家[1-2]。鵝肉作為高蛋白、低膽固醇、低脂肪的綠色營養(yǎng)健康食品，具有藥用、食療功能[3-4]。我國鵝肉產(chǎn)量大，但鵝肉肌纖維粗、硬度較大、嫩度差、不易咀嚼[5]，在一定程度上限制了人們的消費(fèi)，因此急需選擇合適的加工技術(shù)改善鵝肉的品質(zhì)，促進(jìn)鵝肉產(chǎn)業(yè)快速穩(wěn)定發(fā)展。目前，關(guān)于改善肉品品質(zhì)的方法研究較多，主要包括物理法[6-7]、化學(xué)法[8-9]、生物法[10-11]，其中物理方法簡單安全、實(shí)踐應(yīng)用最廣，但可選的方法較少。超聲嫩化是90年代提出的一種與其他的肉類嫩化原理不同的全新嫩化技術(shù)，現(xiàn)普遍認(rèn)為其空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用是超聲技術(shù)的三大理論依據(jù)，“聲耦”作用使肉產(chǎn)生振動，致使肌肉結(jié)構(gòu)破壞，快速嫩化肉品[12]。Lyng[13]、Chemat[14]等均研究發(fā)現(xiàn)超聲可用于提高肉品嫩度。近年來，國內(nèi)也有關(guān)于超聲對肉品嫩度影響的研究[15-16]，結(jié)果均表明超聲對肌肉有顯著嫩化作用。但是，關(guān)于超聲嫩化方法對肉品品質(zhì)的影響及嫩化原理仍需進(jìn)一步研究。本研究通過分析超聲處理鵝胸肉的pH值、肌原纖維小片化指數(shù)（muscle fibrillation index，MFI）、剪切力、熱力學(xué)變化等指標(biāo)，研究其成熟過程中肉品品質(zhì)的變化規(guī)律，為探究鵝肉嫩化機(jī)理、進(jìn)一步提高肉品品質(zhì)提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉用揚(yáng)州鵝購自常州市陽湖養(yǎng)鵝業(yè)專業(yè)合作社，隨機(jī)選取90 日齡左右大小相近的健康鵝，按要求宰殺，并迅速取出鵝胸肉，待用。

二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 南京奧多福尼生物科技有限公司；KCl、NaCl、Na2CO3、NaHCO3（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid，EGTA） 上海麥克林公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；HI-9025酸度計 意大利Hanna公司；UV-6100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TVT-300XP質(zhì)構(gòu)儀 瑞典泰沃公司；T-25型數(shù)顯勻漿機(jī)德國IKA公司；UniCenMR冷凍離心機(jī) 德國Herolab公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；JS-680C全自動凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 德國ZEISS Oberkochen公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料處理

將選取的肉鵝按要求宰殺后，迅速取出胸大肌，選取大小、薄厚相近的鵝胸大肌，剔除肌膜、結(jié)締組織和脂肪組織，待用。

取上述鵝胸大肌，分兩組處理：其中一組進(jìn)行超聲（功率800 W、時間42 min）處理，另一組未經(jīng)超聲處理的鵝胸大肌作為對照組（常規(guī)組）。于4 ℃放置不同時間（0、6、12、24、36、48 h）后分別取樣，經(jīng)液氮速凍后放入-40 ℃冰箱，待用。每組均做3 個平行。

1.3.2 肉品pH值的測定

稱取2 g肉糜于離心管中，加入18 mL去離子水，玻璃棒攪勻后用酸度計測定其pH值，測定3 次取平均值。

1.3.3 MFI值的測定

參考Culler等[17]的方法測定MFI值：稱取2 g肉糜，加入20 mL MFI提取緩沖液（0.1 mol/L KCl、l mmol/L NaN3、7 mmol/L KH2PO4、18 mmol/L K2HPO4、l mmol/L MgCl2、l mmol/L EGTA，pH 7.0、4 ℃），冰浴均質(zhì)（1 2 0 0 0 r/min、3 0 s、2 次），冷凍離心（12 000×g、15 min、4 ℃），棄上清液，沉淀加20 mL MFI提取緩沖液，再次離心（12 000×g、15 min、4 ℃），棄上清液，沉淀加15 mL MFI提取緩沖液，攪勻，經(jīng)兩層紗布過濾，濾液即為肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）溶液。MP溶液用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，用MFI提取緩沖液調(diào)節(jié)MP質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，將稀釋的MP溶液搖勻，立即用紫外-可見分光光度計測定其在540 nm波長處吸光度，測定3 次取平均值。MFI值為540 nm波長處吸光度乘200。

1.3.4 蒸煮損失率、中心蒸煮速率的測定

鵝胸肉塊（（50±5）g）用濾紙吸干表面水分后稱質(zhì)量，記錄蒸煮前肉塊質(zhì)量m1。然后將肉塊置于5 號自封袋中，將數(shù)顯溫度計插入肉塊中央。在95 ℃水浴鍋中加熱至中心溫度75 ℃，立即取出流水沖至室溫，再次用濾紙吸干表面水分后稱質(zhì)量，記錄蒸煮后肉塊質(zhì)量m2。根據(jù)蒸煮前后肉塊質(zhì)量按下式計算得出肉塊蒸煮損失率。

蒸煮損失率測定過程中，記錄各肉塊達(dá)到30、40、50、60、70、75 ℃時所用時間（起始溫度均為12 ℃），計算鵝胸肉中心蒸煮速率。

1.3.5 剪切力的測定

將1.3.4節(jié)蒸煮后的肉塊用手術(shù)刀和直尺沿肌纖維方向切割成3 cm×1 cm×1 cm大小的肉條，使用TVT-300XP質(zhì)構(gòu)儀連接的刀片式探頭，垂直肌纖維的方向進(jìn)行剪切，測定其剪切力變化曲線，記錄最大剪切力，多次測定取平均值。剪切力的測定參數(shù)設(shè)定為：測前速率：10 mm/s；測試速率：2 mm/s；測后速率：10 mm/s；下降距離：30 mm；觸發(fā)力：50 g。

1.3.6 MP的提取

參考Xiong Youling L.[18]的方法提取MP。取2 g鵝胸肉切碎，加8 倍分離緩沖液（0.1 mol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L DTT、10 mmol/L K2HPO4，pH 7.0），冰浴均質(zhì)（10 000×g、10 s、3 次），離心（2 000×g、20 min），棄上清液，取沉淀，重復(fù)3 次。加入8 倍分離緩沖液（0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L NaN3，pH 6.0），均質(zhì)（10 000 r/min、10 s）后用一層干燥潔凈的紗布過濾，離心（2 000×g、20 min），棄上清液，取沉淀，重復(fù)3 次，得到提純的MP沉淀。將沉淀溶于適量的緩沖液（0.6 mol/L KCl、10 mmol/L K2HPO4，pH 6.0）中，待用。

1.3.7 SDS-PAGE分析

取0.2 mL 1.3.6節(jié)提取的MP溶液，加入0.4 mL上樣緩沖液后于95 ℃加熱5 min滅酶，離心（12 000×g、5 min）取上清液用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。采用變性不連續(xù)電泳，質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠、5%濃縮膠（m（丙烯酰胺）∶m（甲叉雙丙烯酰胺）＝36.5∶1）。每孔等體積上樣20 μL，200 V恒壓電泳約50 min。凝膠塊用考馬斯亮藍(lán)染色液染色10 min后取出，加入適量的脫色液，脫色時放在搖床上使脫色更為均勻迅速，1 h后更換脫色液，直至脫色完成，用凝膠成像儀對膠塊進(jìn)行成像分析，并用ImageJ軟件掃描條帶，得出OD值用于數(shù)據(jù)分析。

1.3.8 超微結(jié)構(gòu)分析

鵝胸肉樣的微觀結(jié)構(gòu)用SEM觀察。將處理好的肉樣切成5 mm×2 mm×2 mm小塊，用體積分?jǐn)?shù)3%戊二醛固定，噴金鍍膜后用SEM觀察樣品的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.9 熱力學(xué)性質(zhì)變化分析

以DSC測定樣品熱重（thermogravimetric，TG）/DSC曲線，由變性溫度（Tg）表征蛋白質(zhì)樣品的熱穩(wěn)定性。鋁坩堝中放入12 mg左右的鵝胸肉樣品。溫度范圍25～105 ℃，升溫速率5 ℃/min，測定其TG/DSC曲線。通過TA Universial Analysis軟件對熱變曲線中的峰處理以得到熱變性溫度（Tm），對其面積積分后得出焓變（ΔH）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)。用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。分析統(tǒng)計圖使用Origin 8.0軟件繪制。采用Dunnett-t進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析，以P＜0.05表示差異或相關(guān)性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝胸肉糜pH值的變化

pH值是反映肉品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[19]。宰后成熟過程中，肌肉pH值先下降后回升：成熟前期，乳酸的累積導(dǎo)致pH值的下降；在后熟期，肌肉轉(zhuǎn)化為可食用肉的過程中，pH值回升，肉質(zhì)變嫩。

圖 1 超聲處理后放置時間對鵝胸肉pH值的影響Fig. 1 Effect of storage time after ultrasonic treatment on pH of goose breast meat

如圖1所示，未超聲處理的常規(guī)組鵝胸肉pH值隨放置時間的延長先降低后升高，pH值降低過程符合肌肉宰后成熟前期排酸規(guī)律，即動物宰后肌肉僵直期，由于氧氣供應(yīng)中斷，肌肉內(nèi)糖酵解生成乳酸，肌肉的排酸過程導(dǎo)致內(nèi)部環(huán)境pH值下降，同時，糖酵解產(chǎn)生的ATP不足以維持肌肉的正常ATP水平，肌動蛋白與肌球蛋白結(jié)合生成肌動球蛋白，使肉品品質(zhì)改變，嫩度減小。隨著放置時間的延長，肌肉進(jìn)入解僵期，肌動球蛋白解離，pH值回升，肌肉重新變?nèi)崮邸?/p>

超聲組pH值隨放置時間的延長先增大后降低。同時，超聲組pH值普遍高于常規(guī)組，這可能是因?yàn)槌暤膹?qiáng)穿透力以及空化效應(yīng)使組織結(jié)構(gòu)在短時間內(nèi)遭到破壞，釋放嫩化酶，縮短肌肉宰后成熟過程，使肌肉快速進(jìn)入后熟期，從而使pH值升高，進(jìn)一步利于肉質(zhì)嫩化。這與高海燕等[20]的結(jié)論相似，在尸僵階段，宰后雞肉pH值持續(xù)下降，此時肉的持水性最差，在后熟階段，肌肉的pH值又開始回升，遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，肉的保水性也提高，變得柔嫩多汁。這說明超聲處理有助于縮短肌肉成熟過程，對肌肉品質(zhì)有顯著影響。

2.2 鵝胸肉糜MFI值的變化

鵝宰后僵直成熟過程中，完整的肌原纖維斷裂成肌節(jié)小片，MFI是衡量動物宰后肌原纖維隨時間變化的參數(shù)，可作為表征嫩度的重要指標(biāo)[21]，MFI值越大，肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞程度越大。

由圖2可看出，超聲組的MFI值顯著大于常規(guī)組，隨著放置時間的延長，超聲組MFI值變化不明顯；常規(guī)組MFI值隨著放置時間的延長不斷增加，放置時間48 h時常規(guī)組MFI值接近超聲組初始放置時間的MFI值。這與李誠等[22]的研究結(jié)果相符，宰后成熟初期MFI值增加不明顯，隨著宰后成熟時間的延長，由于肌肉中組織蛋白酶及其他因素的影響，肌原纖維降解，肌原纖維的結(jié)構(gòu)遭到破壞，完整的肌原纖維斷裂形成肌節(jié)小片，MFI值顯著增加，成熟72～96 h后，MFI值增加幅度逐漸減小，因此在成熟后期MFI值變化不顯著。以上結(jié)果表明，超聲具有的強(qiáng)穿透力和空化效應(yīng)等，可以促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)破壞，肌原纖維、結(jié)締組織等在短時間內(nèi)遭到破壞，一方面釋放嫩化酶，另一方面，肌纖維破碎斷裂成為肌節(jié)小片，小片化程度在短時間內(nèi)顯著增大。因此，超聲處理使鵝胸肉MFI值在短時間內(nèi)達(dá)到成熟后期水平，縮短了鵝胸肉宰后成熟期，有助于改善肉質(zhì)嫩度，這也與pH值的分析結(jié)果一致。

圖 2 超聲處理后放置時間對鵝胸肉MFI值的影響Fig. 2 Effect of storage time after ultrasonic treatment on MFI of goose breast meat

2.3 鵝胸肉塊中心蒸煮速率的變化

圖 3 超聲處理后放置時間對鵝胸肉中心蒸煮速率的影響Fig. 3 Effect of storage time after ultrasonic treatment on cooking rate of goose breast meat

由圖3可知，與常規(guī)組相比，超聲組的中心溫度變化更快，加熱到所需溫度需要的時間更短。鵝胸肉中心溫度在20～75 ℃范圍內(nèi)，兩組中心溫度上升速率均有顯著性差異（P＜0.05）。隨著中心溫度的繼續(xù)升高，兩組鵝胸肉加熱到同一溫度時消耗的時間也存在顯著性差異（P＜0.05），超聲組的中心溫度達(dá)70 ℃時，常規(guī)組僅為60 ℃。由此可知，超聲處理能夠縮短鵝胸肉的煮制時間，超聲組相對于常規(guī)組對熱能的利用效率更高。

2.4 鵝胸肉塊蒸煮損失率的變化

由圖4可知，超聲組的蒸煮損失率呈先下降后上升的趨勢，與常規(guī)組相比，超聲對蒸煮損失率的影響在宰后成熟前期比較明顯。常規(guī)組的蒸煮損失率呈先上升后下降趨勢，蒸煮損失率在放置12 h時達(dá)到最高，這是因?yàn)樵缀蠹∪庀冉?jīng)過僵直階段，肌肉嫩度下降，保水性降低，在隨后解僵階段，肌肉嫩度回升，保水性提高，從而使蒸煮損失率降低。而超聲組的蒸煮損失率在放置6 h時最低，且超聲處理顯著減小了鵝胸肉的蒸煮損失率，這可能是因?yàn)槠浼铀倭嗽缀蟪墒爝^程，使蒸煮損失率降低，這與劉功明等[23]的結(jié)果相符。這是由于超聲處理破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+外流，活化鈣激活酶，進(jìn)而促進(jìn)了MP的分解，提高了肉的嫩度。同時，超聲處理在一定程度上促進(jìn)了鹽溶性蛋白向肉表面的富集，提高肉塊表面阻止水分向外擴(kuò)散的能力；而且超聲的空化效應(yīng)可以穿透組織內(nèi)部，破壞肉的肌原纖維結(jié)構(gòu)，釋放出更多的鹽溶性蛋白，增強(qiáng)肌肉蛋白結(jié)合水的能力，減少在加熱過程中肉汁的外溢，有效減小蒸煮損失[24-25]。

圖 4 超聲處理后放置時間對鵝胸肉蒸煮損失率的影響Fig. 4 Effect of storage time after ultrasonic treatment on cooking loss of goose breast meat

2.5 鵝胸肉塊剪切力的變化

圖 5 超聲處理后放置時間對鵝胸肉剪切力的影響Fig. 5 Effect of storage time after ultrasonic treatment on shear force of goose breast meat

剪切力是反映肌肉嫩度的直接指標(biāo)，剪切力越大肌肉越嫩，剪切力的大小與肌纖維直徑、水分含量、成熟程度等密切相關(guān)[23]。如圖5所示，超聲組的剪切力呈先下降后上升的趨勢，而常規(guī)組有相反的趨勢，且超聲組的剪切力顯著低于常規(guī)組，與蒸煮損失變化趨勢基本相同。超聲處理可以在較短時間內(nèi)達(dá)到常規(guī)組更長成熟時間的嫩化效果，這是由于超聲的空化效應(yīng)等使得鵝胸肉的肌原纖維結(jié)構(gòu)完整性在短時間內(nèi)遭到破壞，細(xì)胞膜的通透性改變，肌漿蛋白溶出，組織內(nèi)的嫩化酶被釋放，使鵝胸肉的嫩化效果顯著高于常規(guī)組。隨著放置時間的延長，超聲組的剪切力值呈上升趨勢，放置48 h時剪切力大小趨向常規(guī)組0 h，可能是超聲處理對縮短鵝胸肉宰后僵直期、嫩化肌肉有顯著效果。

2.6 鵝胸肉塊肌動蛋白SDS-PAGE分析

圖 6 鵝胸肉肌動蛋白的SDS-PAGE圖（A）和定量分析圖（B）Fig. 6 SDS-PAGE patterns (A) and quantity analysis (B) of actin content in goose breast meat

超聲組和常規(guī)組在不同放置時間下MP的SDS-PAGE分析如圖6所示，肌球蛋白為大分子蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為510 kDa，難以在電泳圖中進(jìn)行表征，而肌動蛋白分子質(zhì)量為43 kDa，在電泳實(shí)驗(yàn)中可使用常規(guī)寬分子質(zhì)量Marker進(jìn)行參照，操作比較簡單方便,因此多以肌動蛋白含量表征肌動球蛋白解離情況。圖6A電泳圖為肌動蛋白條帶，通過定量分析（圖6B）可知，常規(guī)組的肌動蛋白含量隨著放置時間的延長逐漸減少，而超聲組在放置12～48 h時游離態(tài)肌動蛋白含量逐漸增多，表明肌動球蛋白大量解離。這是由于宰后成熟過程中，肌肉先經(jīng)歷僵直期，肌動蛋白和肌球蛋白大量結(jié)合形成肌動球蛋白，使得肌動蛋白含量降低，肌肉嫩度下降。而在肌肉解僵期，肌動球蛋白大量解離形成肌動蛋白和肌球蛋白，肌動蛋白含量增加[26]。超聲處理破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放組織蛋白酶和鈣蛋白酶，在酶體系的作用下，加速了肌動球蛋白降解，大量肌動蛋白形成，對嫩化肌肉、縮短宰后僵直期有顯著效果，這也與剪切力及pH值等指標(biāo)的結(jié)論相符。

2.7 鵝胸肉塊超微結(jié)構(gòu)的變化分析

通過SEM觀察，與常規(guī)組相比，超聲處理對鵝胸肉超微結(jié)構(gòu)的影響如圖7所示。由圖7可以看出，超聲組的SEM圖可觀察到鵝胸肉肌原纖維間明顯的空隙、空洞和肌節(jié)。常規(guī)組隨著放置時間的延長肌原纖維間隙不斷增大，肌纖維由緊密排列逐漸變松散。超聲組放置0 h的鵝胸肉肌纖維間隙較常規(guī)組放置24 h更明顯，這可能是由于超聲的空化效應(yīng)使肌纖維之間出現(xiàn)空洞，孔隙增大，肌肉結(jié)構(gòu)變松散，促進(jìn)鵝胸肉嫩化，在放置48 h時超聲組鵝胸肉肌纖維排列重新變緊密，這可能由于物理嫩化不能徹底改變肌肉蛋白的結(jié)構(gòu)，放置一段時間后，肌動蛋白和肌球蛋白重新結(jié)合，肌節(jié)橫向收縮，肌纖維結(jié)構(gòu)逐漸復(fù)位。這也與上述指標(biāo)的變化趨勢相符。

2.8 鵝胸肉塊熱力學(xué)性質(zhì)變化分析

圖 8 鵝胸肉的DSC圖Fig. 8 DSC thermogram of goose breast meat

如圖8所示，熱流曲線上出現(xiàn)了2 個峰，分別為峰I、峰II。Martens[27]、Dergez[28]、Palka[29]等的研究顯示，峰I為肌球蛋白熱變性引起的熱流變化，峰II則由肌動蛋白熱變性引起。

表 1 超聲處理后不同放置時間的鵝胸肉的變性溫度和變性焓Table 1 Thermal denaturation temperature and denaturation enthalpy of goose breast meat subjected ultrasonic treatment during different storage times

由表1可知，超聲組熱變性溫度Tm（包括T1和T2）左移，代表肌球蛋白熱變性溫度的峰值T1和代表肌動蛋白熱變性溫度的峰值T2均較常規(guī)組低，焓變（ΔH1、ΔH2）亦呈減小的趨勢。超聲處理后鵝胸肉的兩個峰值變性溫度在0～24 h均低于常規(guī)組，表明超聲處理對肌球蛋白和肌動蛋白的熱穩(wěn)定性具有顯著影響，這也與史培磊等[30]的結(jié)果一致，可能是超聲處理導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)改變，空間立體性增加，構(gòu)象的變化導(dǎo)致相變或者蛋白質(zhì)間交聯(lián)作用改變，促進(jìn)了MP粗、細(xì)絲間的距離增大、MP骨架的降解等，這也與SDS-PAGE分析及SEM觀察等結(jié)果相符。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對未超聲處理的常規(guī)組和超聲組在4 ℃下放置不同時間鵝胸肉進(jìn)行分析，結(jié)果表明超聲處理可升高鵝胸肉pH值，縮短鵝胸肉成熟所需時間，顯著減小蒸煮損失率和剪切力，致使肉品熱敏性和表面微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，肌動蛋白含量顯著增大（P＜0.05），從而改善鵝胸肉嫩度。但這仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尤其是將超聲與肌動球蛋白解離聯(lián)系在一起并延長處理后的放置時間，以確定肌動球蛋白解離與超聲嫩化之間的關(guān)系，這將有助于更清楚地了解鵝胸肉的宰后成熟機(jī)理，為進(jìn)一步改善鵝肉品質(zhì)提供理論依據(jù)。