牛小雪，陳培柱，杜玉芝，徐紅梅

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院藥學(xué)系，安徽 合肥 230009)

程氏蠲痹湯是清代新安醫(yī)家程國(guó)彭創(chuàng)立的著名方劑，臨床用于治療痹病十分有效[1-3]，為歷代醫(yī)家所推崇。風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。程氏蠲痹湯由羌活、獨(dú)活、秦艽、當(dāng)歸等10味藥材組成，具有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血行滯等功效[4-5]，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有較好的療效，但有關(guān)其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究尚顯不足。本實(shí)驗(yàn)對(duì)程氏蠲痹湯的抗炎、鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為其臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物 中藥材秦艽(批號(hào) 15020703)、羌活(批號(hào) 14011505)、獨(dú)活(批號(hào) 14042504)、川芎(批號(hào) 14051601)、當(dāng)歸(批號(hào) 14051401)、海風(fēng)藤(批號(hào) 15020603)、桑枝(批號(hào) 14041803)、木香(批號(hào) 14031602)、乳香(批號(hào) 13112901)和甘草(批號(hào) 13050801)為程氏蠲痹湯原方藥物，均購(gòu)自合肥樂(lè)家老鋪中藥材有限公司。

藥材中揮發(fā)油成分的提?。喝—?dú)活、海風(fēng)藤各100 g，乳香、木香各60 g，投入10 L圓底燒瓶，加入8倍量蒸餾水，熱回流提取2次，收集揮發(fā)油，4 ℃遮光儲(chǔ)藏、備用。

藥材中醇溶性、水溶性成分的提取：取獨(dú)活、川芎、當(dāng)歸和秦艽各100 g，甘草30 g，羌活60 g和桑枝150 g，用75%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾、濾液濃縮得浸膏A。藥渣再用水煎煮2次，每次2 h，過(guò)濾、濃縮得浸膏B。程氏蠲痹湯藥液：合并上述醇提物(A)、水提物(B)和揮發(fā)油，減壓濃縮，使藥液的生藥含量為1.02 g/mL，4 ℃遮光儲(chǔ)藏，備用。使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液稀釋至1.02、0.51、0.255 g/mL。

雷公藤多苷片(glucosides ofTripterygiumwifordii，GTW；批號(hào) 141202)：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；阿司匹林腸溶片(批號(hào) 100901)：廣東九名制藥有限公司。實(shí)驗(yàn)前均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度。

1.2 試劑 二甲苯：國(guó)藥集團(tuán)；角叉菜膠(批號(hào) CAS 11114-20-8)：Adamas公司；弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA；批號(hào) CAS 9007-81-2)：Sigma公司。

1.3 儀器 JA 2004 N 型電子天平：上海精密科學(xué)儀器公司；YLS-7B足趾容積測(cè)量?jī)x：淮北振華公司；RB-200熱板儀：上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司；打孔器。

1.4 動(dòng)物 雌性昆明種小鼠[100只，體質(zhì)量(20±2)g]、雄性昆明種大鼠[96只，體質(zhì)量(180±20)g]：均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2017-001]提供。

2 方法

2.1 程氏蠲痹湯對(duì)熱板致痛小鼠痛閾的影響 取雌性昆明種小鼠，放在(55.0±0.5)℃的金屬熱板上，測(cè)定每只小鼠的痛閾值(即疼痛反應(yīng)潛伏期，指小鼠接觸熱板至舔后足的時(shí)間)，痛閾在5～30 s內(nèi)為痛閾正常小鼠。取痛閾正常小鼠50只，隨機(jī)分為空白組，阿司匹林組(0.05 g/kg)，程氏蠲痹湯高劑量(20.40 g/kg，相當(dāng)于60 kg成人臨床用藥量的24倍)、中劑量(10.20 g/kg)、低劑量(5.10 g/kg)組。各組小鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，空白組小鼠給予等容積溶媒。末次給藥1 h后，以小鼠出現(xiàn)舔后足行為作為疼痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄自投入熱板至出現(xiàn)舔后足的潛伏期，連續(xù)測(cè)量3次，取平均值為痛閾。鎮(zhèn)痛效應(yīng)的計(jì)算公式：痛閾提高百分率=[(給藥后痛閾-給藥前痛閾)/給藥前痛閾]×100%。

2.2 程氏蠲痹湯對(duì)小鼠急性炎癥耳腫脹度的影響 取雌性昆明種小鼠50只，分組與給藥同“2.1”項(xiàng)。末次給藥1 h后，將0.025 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠左耳正反兩面，以右耳為對(duì)照，復(fù)制小鼠急性炎癥模型。致炎30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死，用直徑9 mm的打孔器，在左右耳廓相同部位打孔取樣，及時(shí)稱量耳片質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹度(左右耳片質(zhì)量差值)及耳腫脹抑制率。耳腫脹抑制率=[(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度] ×100%。

2.3 程氏蠲痹湯對(duì)大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 取雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、GTW組(0.01 g/kg)和程氏蠲痹湯高劑量(10.20 g/kg)、中劑量(5.10 g/kg)、低劑量(2.55 g/kg)組。各組大鼠灌胃給藥，正常組和模型組均灌胃等容量空白溶劑，每日1次，連續(xù)14 d。末次給藥后1 h，于大鼠左后足踝關(guān)節(jié)處作標(biāo)記，測(cè)量大鼠足體積。除正常組外，在其他組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL角叉菜膠溶液復(fù)制炎癥模型，并于致炎后1、2、4、6 h分別測(cè)定大鼠左后足體積。足腫脹率=[(Vt-Vn)/Vn]×100%，Vn、Vt分別代表大鼠致炎前、致炎后足體積。

2.4 程氏蠲痹湯對(duì)大鼠慢性炎癥足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分的影響 動(dòng)物分組及給藥同“2.3”項(xiàng)。除正常組外，其余各組大鼠均于左后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL CFA復(fù)制佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型。致炎后第15天灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d。

2.4.1 足腫脹度的檢測(cè) 在致炎前及致炎后第14、17、20、22、25、28天分別測(cè)量各組大鼠的左后足體積及繼發(fā)側(cè)足體積，并計(jì)算各組大鼠足腫脹率，計(jì)算方法同“2.3”項(xiàng)。

2.4.2 屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分(縮腿嘶鳴評(píng)分) 在致炎第0、5、14、20、26天，進(jìn)行背屈和趾屈關(guān)節(jié)疼痛實(shí)驗(yàn)評(píng)分。具體如下：用固定器將大鼠頭部固定，使其兩后腿和尾部伸出，穩(wěn)定后進(jìn)行測(cè)定。①趾屈：將大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)向腳掌側(cè)緩慢且柔和彎曲，每間隔5 s進(jìn)行一次，共5次。若大鼠出現(xiàn)短促而明顯的縮腿或嘶叫反應(yīng)則評(píng)分為1，無(wú)反應(yīng)評(píng)分為0。分別記錄其縮腿和嘶叫評(píng)分，每種指標(biāo)的評(píng)分為0～5分，兩種指標(biāo)的評(píng)分相加，每只大鼠的總評(píng)分為0～10分。②背屈：將大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)向腳背側(cè)緩慢且柔和彎曲，評(píng)分方法同趾屈關(guān)節(jié)評(píng)分。用縮腿和嘶叫二者的總評(píng)分來(lái)反映大鼠關(guān)節(jié)疼痛的程度。

3 結(jié)果

3.1 程氏蠲痹湯對(duì)小鼠痛閾的影響 與空白組比較，給藥組小鼠更耐痛，痛閾提高百分率顯著上升(P<0.05)；其中程氏蠲痹湯高、中劑量組痛閾提高百分率與阿司匹林組相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 程氏蠲痹湯對(duì)小鼠痛閾的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05

3.2 程氏蠲痹湯對(duì)小鼠耳腫脹度的影響 與空白組比較，二甲苯致炎后，阿司匹林組和程氏蠲痹湯高、中劑量組小鼠耳腫脹度顯著降低(P<0.05)；程氏蠲痹湯低劑量組對(duì)小鼠耳腫脹的抑制率顯著低于阿司匹林組(P<0.05)，而其高、中劑量組藥效與阿司匹林組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3.3 程氏蠲痹湯對(duì)大鼠急性炎癥足腫脹率的影響 角叉菜膠致炎1 h后，即可引起模型組大鼠足部顯著腫脹(P<0.05)；在致炎后各時(shí)間段，GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠的足腫脹率均顯著低于模型組(P<0.05)，且致炎后4 h效果最為顯著；程氏蠲痹湯低劑量組大鼠足腫脹率在致炎后2～6 h與GTW組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其高、中劑量組與GTW組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 程氏蠲痹湯對(duì)小鼠耳廓腫脹度的影響

注：與空白組比較，*P<0.05；與阿司匹林組比較，#P<0.05

表3 程氏蠲痹湯對(duì)大鼠急性炎癥足腫脹率的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05；與致炎1 h后比較，aP<0.05；與致炎2 h后比較，bP<0.05；與致炎4 h后比較，cP<0.05

3.3 程氏蠲痹湯對(duì)AA大鼠疼痛與足腫脹率的影響 AA大鼠在致炎后第14 d，其原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足腫脹率、屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分明顯高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，致炎后第20天，GTW組和程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠原發(fā)側(cè)及繼發(fā)側(cè)足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分明顯降低(P<0.05)；且程氏蠲痹湯高、中劑量組大鼠足腫脹率和屈關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分與GTW組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、表5。

表4 程氏蠲痹湯對(duì)AA大鼠原發(fā)側(cè)和繼發(fā)側(cè)足腫脹率的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05

4 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)，根據(jù)持續(xù)時(shí)間不同分為急性和慢性。急性炎癥以發(fā)紅、腫脹、疼痛等為主要癥狀，而慢性炎癥可由急性炎癥遷延而來(lái)，病程較長(zhǎng)，且臨床表現(xiàn)多樣，診斷及治療相對(duì)困難。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其基本病理是由免疫失控所引發(fā)的慢性滑膜炎癥，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、僵直，屈伸不利[6-7]。持續(xù)的慢性炎癥可引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的損害，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形，給患者帶來(lái)極大的痛苦。目前臨床上對(duì)RA的治療主要是緩解急性發(fā)作癥狀(如關(guān)節(jié)疼痛和腫脹)，抑制炎性因子的釋放以及提高機(jī)體免疫抑制功能等。中醫(yī)藥因其治療RA療效確切，毒性和不良反應(yīng)較小而引起醫(yī)學(xué)界的極大關(guān)注。

表5 程氏蠲痹湯對(duì)AA大鼠縮腿嘶鳴評(píng)分的影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與GTW組比較，#P<0.05

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，程氏蠲痹湯方中秦艽具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，可調(diào)節(jié)機(jī)體炎性因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-4的表達(dá)[8-9]。海風(fēng)藤提取物可以通過(guò)降低大鼠滑膜組織中腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6、核因子-κB、核因子-κB抑制因子和核因子-κB激酶抑制因子及其mRNA的表達(dá)，發(fā)揮其抗炎、抗風(fēng)濕作用[10]。桑枝、木香可通經(jīng)活絡(luò)，佐以當(dāng)歸、川芎、乳香可理氣養(yǎng)血、活血行滯。許霞等[11]研究發(fā)現(xiàn)，程氏蠲痹湯加減方含藥血清可以下調(diào)AA大鼠外周血單核細(xì)胞腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β的水平。但程氏蠲痹湯的抗炎鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療效果卻鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱板法和二甲苯致炎法[12-13]考察程氏蠲痹湯對(duì)小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛效果；利用角叉菜膠[14]和弗氏完全佐劑復(fù)制大鼠炎癥模型，分別評(píng)價(jià)程氏蠲痹湯對(duì)大鼠急性和慢性炎癥的療效。結(jié)果顯示，20.40、10.20 g/kg程氏蠲痹湯可顯著提高小鼠的痛閾，抑制急性耳腫脹，10.20、5.10 g/kg程氏蠲痹湯可顯著緩解大鼠炎性足腫脹，并減輕AA大鼠屈關(guān)節(jié)疼痛。結(jié)果表明，程氏蠲痹湯對(duì)小鼠、大鼠的急性和慢性炎癥均具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果。本研究結(jié)果可為程氏蠲痹湯治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其抗炎鎮(zhèn)痛的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。