劉海濤，邵 杰，王 剛，梁益敏，楊 陵，王國凱

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院 安徽道地中藥材品質提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012； 2.安徽邦寧制藥有限公司，安徽 寧國 242300)

植物內生菌是指其生長發(fā)育時期生活在健康植物組織內部，并不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的微生物，包括內生細菌和內生真菌[1]。內生真菌廣泛存在于植物各個器官、組織的細胞內及細胞間隙之中，由于它們和其寄主植物長期共生，內生真菌除了產(chǎn)生一些獨特的代謝產(chǎn)物外，還往往可以產(chǎn)生與寄主植物代謝產(chǎn)物相近甚至相同的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，研究表明這些活性成分具有顯著的抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[2-4]。

中藥前胡為傘形科植物白花前胡(P.praeruptorumDunn.)的干燥根，始載于《名醫(yī)別錄》，具有宣散風熱、降氣祛痰的功效，可用于風熱感冒、咳嗽痰多、痰熱喘滿等癥[5]。安徽省寧國市地處皖南山區(qū)天目山北麓，素以盛產(chǎn)道地藥材白花前胡而著稱。該地所產(chǎn)前胡以個大、皮黑、肉白、條長、柔軟、香味濃等特點著稱，商品市場俗稱“寧前胡”[6]。目前國內外研究者對白花前胡化學成分和藥理活性等進行了廣泛的研究[7-9]，但尚未見有關于寧前胡內生真菌的研究報道。本研究首次從寧前胡中分離鑒定出多種內生真菌，豐富了寧前胡內生真菌的種質資源，并為進一步尋找內生真菌的次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 寧前胡藥材于2017年6月采自安徽省寧國市港口鎮(zhèn)株木店村，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學梁益敏副教授鑒定為傘形科前胡屬白花前胡(P.praeruptorumDunn.)。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器 SPT-P250C智能生化培養(yǎng)箱：合肥華德利科學器材有限公司；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；SW-CJ-2FD雙人單面潔凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司；T-Gradient Thermoblock PCR儀：德國Biometra公司；G-BOX凝膠成像系統(tǒng)Gene-Snap：英國Syngene公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；通用引物：內轉錄間隔區(qū)ITS1(5′-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′)均由上海生工生物工程股份有限公司定制。

2 方法

2.1 內生真菌的培養(yǎng)分離與純化 采用組織塊法分離內生真菌。保存完好的寧前胡根部，去除須根和葉子，用蒸餾水把根部沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，晾干。按照常規(guī)表面無菌操作法：依次用75%乙醇漂洗1～2 min，3%次氯酸鈉漂洗3～5 min，75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗5次。設置空白對照，用移液槍移取最后一次沖洗的無菌水200 μL，用涂布棒均勻涂布于PDA培養(yǎng)基的表面，倒置于恒溫28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，平行3份以驗證滅菌效果是否徹底。然后用無菌濾紙充分吸干寧前胡表面水分，再用無菌手術刀將材料切成0.2 cm×0.2 cm長段(片)，將上述組織塊分別接種于PDA培養(yǎng)基中，每皿4塊，置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5～15 d。觀察組織塊斷面處向PDA培養(yǎng)基周圍長出形態(tài)特征、顏色差異的菌落時，用無菌接種環(huán)挑取形態(tài)各異的菌絲或孢子接種于新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～4代，待純化后轉移到PDA斜面試管中編號備用。

2.2 菌株的形態(tài)學初步鑒定 將保存完好的菌株復壯到PDA培養(yǎng)基平板上，恒溫28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10 d。內生真菌主要的形態(tài)特征包括所分得的菌落大小、表面特征、菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結構類型以及孢子的形態(tài)，參照《真菌鑒定手冊》[10]進行初步鑒定分類。

2.3 菌株的分子鑒定

2.3.1 內生真菌DNA提取 將純化的內生真菌用無菌藥匙刮取表面，放入無菌研缽中，加入2～3次液氮冷凍菌絲體，然后用研杵充分研磨冷凍的菌絲體，應隨時補充液氮以保持低溫，參照試劑盒步驟進行操作，得到DNA溶液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 rDNA-ITS的PCR擴增 擴增真菌rDNA-ITS的上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物 ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系50 μL，見表1。

表1 PCR擴增rDNA-ITS的反應體系

2.3.3 PCR擴增程序和內生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 PCR擴增程序：參照文獻[11]中的方法，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物，后將擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，由凝膠成像系統(tǒng)進行觀察、拍照。檢測后置于-20 ℃冰箱中保存，備用。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序，將測序結果提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫，與相關種屬序列進行同源性比較，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。利用美國國家生物技術信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)數(shù)據(jù)庫BLAST對序列進行相似性分析，對菌株進行鑒定，從而得到真菌的分類地位，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 分析方法 定植率(colonization rate，CR)=受內生真菌侵染的組織塊數(shù)/全部供試樣本組織塊數(shù)×100%。內生真菌的CR可以反映宿主植物受內生真菌侵染的程度[12]。分離頻率(separation frequency，SF)=分到內生真菌各屬的分離數(shù)/分到內生真菌分離總數(shù)×100%。SF>10%的屬定義為某樣區(qū)的優(yōu)勢屬，5%≤SF≤10%定義為常見屬，SF<5%定義為稀有屬。相對分離頻率(relative separation frequency，RSF)=分離的某種內生真菌的菌株數(shù)/分離的總菌株數(shù)×100%。RSF可以用來計算植物組織中某種真菌的優(yōu)勢度[13]。

3 結果

3.1 寧前胡內生真菌的分離 兩個批次共120個組織塊來源于6株白花前胡植株樣本，有96個組織塊不同程度上侵染有內生真菌，CR為80%。通過組織塊法從寧前胡中共計分離得到41株內生真菌，分屬于10屬21種。Fusarium12株，Penicillium8株，Aspergillus4株，Alternaria8株，Tricladium1株，Phoma1株，Collariella1株，Rhizoctonia2株，Colletotrichum1株，Trichoderma3株。

3.2 形態(tài)學鑒定 內生真菌通過菌落特征比對和顯微觀察，LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19表面菌絲相對密集，棉絮狀，有大量分生孢子，分生孢子梗集結成分生孢子座，細長，分枝，大孢子彎曲呈不明顯的鐮刀形，小型孢子為長卵圓形。LH02、LH04、LH07、LHT15菌落生長初期為白色，逐漸變?yōu)榫G色或墨綠色，粉狀，孢子梗直立，頂端一至多次分枝，形成掃帚狀，分枝頂端生瓶狀小梗，頂端生成串的分生孢子。LHT17、LHT20、LHT21菌絲密集，由白色漸變?yōu)槟G色，氣生菌絲不發(fā)達，菌絲有隔膜，分生孢子倒棍棒形，橢圓形或卵圓形，頂端有噱狀細胞和磚隔狀的分生孢子。LH09、LH11菌落表面初期為白色，逐漸變?yōu)樯詈稚?，生成眾多的小顆粒狀孢子團，產(chǎn)大量黑色或褐色孢子粉，分生孢子串生、無色，有球形或卵圓形的。LH01、LHT14菌落初為白色，生長迅速，菌絲多為基內生菌絲，漸變?yōu)榫G色，具有透明的瓶梗，分生孢子一般光滑，典型形狀為橢圓形至近似長方形，很少為球形，大多數(shù)為綠色或者透明。根據(jù)魏景超[10]編著的《真菌鑒定手冊》，將LH03、LH06、LH10、LHT16、LHT19初步鑒定為鐮孢霉屬(Fusarium)；LH02、LH04、LH07、LHT15初步鑒定為青霉屬(Penicillium)；LHT17、LHT20、LHT21初步鑒定為鏈格孢屬(Alternaria)；LH09、LH11初步鑒定為曲霉屬(Aspergillus)；LH01、LHT14初步鑒定為木霉屬(Trichoderma)；菌株LHT12因不產(chǎn)孢子，形態(tài)和顯微鑒定沒有意義，故通過分子生物學鑒定。初步鑒定為鐮孢霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬和木霉屬，5個屬的形態(tài)與顯微形態(tài)特征見圖1。

3.3 分子生物學鑒定

3.3.1 PCR擴增產(chǎn)物電泳結果 對分離得到的21種內生真菌進行DNA提取，得到DNA提取液，進行rDNA-ITS序列擴增，550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶，見圖2。

圖1 內生真菌菌落及顯微結構

注：M.marker；1. LH1；2. LH2；3. LH3；4. LH4；5. LH5；6. LH6；7. LH7；8. LH8；9. LH9；10. LH10；11. LH11；12. LHT12；13. LHT13；14. LHT14；15. LHT15；16. LHT16；17. LHT17；18. LHT18；19. LHT19；20. LHT20；21. LHT21

圖2內生真菌16 S rDNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

3.3.2 rDNA-ITS序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 登陸NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)，將測序結果與Genbank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對分析，結果見表2。

表2 分離純化得到白花前胡內生真菌及鑒定結果

利用MEGA 4.0和Clustal X軟件對表2中21種rDNA-ITS分子序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖3。

由表2和圖3可知，寧前胡內生真菌分布于10個屬中，其種類資源非常廣泛。主要分布于Fusarium、Penicillium和Alternaria屬中，占其總數(shù)的68.29%。分布最廣的為Fusarium，共有12株，其RSF為29.27%。而Fusarium中的F.tricinctum和F.verticillioides為其優(yōu)勢種，其RSF分別為9.76%和7.32%。菌株LHT12通過分子生物學鑒定為Rhizoctoniabataticola，共有2株，其RSF為4.88%。

圖3 寧前胡內生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論

藥用植物內生真菌長期生活在植物體內的特殊環(huán)境，其在演化過程中兩者形成了互惠共生關系，已有研究結果顯示，內生真菌的多樣性受生境的影響顯著，不同產(chǎn)地的同一種藥用植物中內生真菌的群落結構存在較大的區(qū)別[14]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，對傘形科植物內生真菌研究較少，本研究對安徽道地藥材寧前胡內生真菌進行培養(yǎng)分離與鑒定，結果顯示分布最廣的類群是鐮孢霉屬Fusariumsp.，SF為29.27%，為其優(yōu)勢種屬。鐮孢霉屬廣泛存在于自然界中，在霍山石斛[15]、亳芍[16]、海南粗榧[17]等植物中廣泛存在，能產(chǎn)生重要的活性成分。本研究共分離鑒定5種鐮孢霉屬真菌，分別為unculturedFusarium、F.oxysporum、F.tricinctum、F.verticillioides和F.proliferatum。本研究后期將對寧前胡內生真菌優(yōu)勢種屬的次級代謝產(chǎn)物進行研究，以期從中尋找到具有生物活性的先導化合物。