竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察方法的現(xiàn)狀

張磊　崔英健　陳華

摘 要：目的 竇房結(jié)是生物體心臟起搏點，因為竇房結(jié)的起搏，心臟才會收縮舒張，將血液泵至全身各器官組織。本文從取材方法、染色方法、觀察技術(shù)、未來展望四個方面對竇房結(jié)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察方法進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：竇房結(jié)；組織學(xué)；形態(tài)學(xué)

中圖分類號：R322.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.10.010

文章編號：1006-1959（2018）10-0030-04

Current Status of Morphological and Histological Observation of Sinoatrial Node Cells

ZHANG Lei1，CUI Ying-jian2，CHEN Hua1，ZHANG Fei1，ZHANG Yue1，ZHONG Qi1，LIU Shuang1，TAN Jian-ye1

Grade 2014，Clinical Medicine1，Department of Human Anatomy2，School of Medicine，Anhui University Of Science and Technology， Huainan 232001，Anhui，China）

Abstract：Objective Sinoatrial node is the pacemaker of biological heart， because the pacing of sinoatrial node will make the heart contract and relax，and pump blood into all organs and organs of the body.In this paper，the progress of morphological and histological observation of sinoatrial node cells was reviewed from four aspects：the method of taking material， the staining method，the observation technique and the future prospect.

Key words：Sinoatrial node；Histology；Morphology

隨著科技的發(fā)展，光鏡-電鏡的發(fā)明，人們對于心臟的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)研究有了更進(jìn)一步的研究。人們在面對以往束手無策的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病，有了人工瓣膜替換術(shù)和射頻消融術(shù)，甚至可以用心臟移植來治療疾病。而如今又有學(xué)者在動物體初步嘗試自體竇房結(jié)細(xì)胞移植來治療心臟部分心臟疾病，直到2013年張亞飛等[1]實驗證明帶蒂移植入自體心室的竇房結(jié)組織細(xì)胞可以和心肌細(xì)胞建立細(xì)胞連接，就此翻開了心臟竇房結(jié)研究的新篇章。由此可見，人們對心臟的認(rèn)識不再僅僅局限于大體上，而是進(jìn)一步發(fā)展到了顯微、亞顯微，甚至分子水平。本文就竇房結(jié)的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察進(jìn)展綜述，以期有助于竇房結(jié)的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)解剖和竇房結(jié)移植的發(fā)展。

1竇房結(jié)概述

竇房結(jié)（sinoatrialnode，SAN）是位于哺乳動物右心房上的一個特殊的小結(jié)節(jié)，由特殊的細(xì)胞構(gòu)成。它可以自動地、有節(jié)律地產(chǎn)生電流，電流按傳導(dǎo)組織的順序傳送到心臟的各個部位，從而引起心肌細(xì)胞的收縮和舒張，從而促使動脈血向遠(yuǎn)心端流動，同時促進(jìn)靜脈血回流。機(jī)體正常的心跳就是從這里發(fā)出的，這就是“心臟的正常起搏點”，竇房結(jié)就是心臟的主要起搏點[2，3]。竇房結(jié)細(xì)胞相當(dāng)于一個“血泵”的發(fā)動機(jī)，啟動整個心臟的跳動，使血液規(guī)律地在全身循環(huán)，供應(yīng)全身各處的氧氣和營養(yǎng)。

2取材方法的進(jìn)展

動物體竇房結(jié)區(qū)定位、取材，是竇房結(jié)觀察的關(guān)鍵步驟之一，因為取材、定位是否準(zhǔn)確，將直接影響顯微鏡下竇房結(jié)細(xì)胞的觀察。目前文獻(xiàn)記載的竇房結(jié)組織取材定位大致有五類方法。

2.1根據(jù)竇房結(jié)的解剖位置來取材 即根據(jù)竇房結(jié)的解剖結(jié)構(gòu)來定位取材。而動物與人的竇房結(jié)位置各有特點：人竇房結(jié)在上腔靜脈和右心房交界處的界溝上1/3的心外膜深面。劉穎等[2]在人心竇房結(jié)組織獲取中采用改良心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)解剖法。按照該位置，先從心臟靜脈竇后方中線沿其長軸剪開，再從界溝左下方、與其平行相距1～1.5 cm處剪開直至越過右心耳嵴到其背后，用剪刀離斷該組織與心房壁的連接處，即獲得含有竇房結(jié)的組織塊。王菲菲等[4]對心源性猝死患者竇房結(jié)細(xì)胞的特殊基因表達(dá)時，在人心臟竇房結(jié)位置獲取竇房結(jié)組織。羊竇房結(jié)縱跨于上、下腔靜脈口的全長之間，大多偏于界溝的腔靜脈竇側(cè)。張海東等[5]在介紹綿羊竇房結(jié)的取材時以該位置為指導(dǎo)獲取竇房結(jié)組織。兔竇房結(jié)主要位于右房界溝的靜脈竇側(cè)，其長軸與界溝平行。祝瑜[6]等在兔竇房結(jié)的取材時按照該位置來取材，成功獲得兔SAN。成年大鼠竇房結(jié)位于上（前）腔靜脈與右心房交界區(qū)及交界區(qū)以上的上（前）腔靜脈壁內(nèi)，呈馬蹄形。彭瑞云等[7]及劉燕青等[8，9]在成年大鼠竇房結(jié)的獲取時，在該位置獲得竇房結(jié)組織。方易冰等[10]在上腔靜脈與右心房交界地明顯搏動部位獲取小鼠竇房結(jié)組織。狗竇房結(jié)位于界溝右側(cè)，在腔耳角下方0.1～0.4 mm處向下延伸，趙欣等[11]在犬心臟腔耳角上方0.5 cm起點、界溝為中線，獲取了竇房結(jié)組織。

2.2打結(jié)定位法和雙酶解法 打結(jié)定位法是指在獲取竇房結(jié)組織過程中，先找到上下腔靜脈后，在兩段用黑線打結(jié)標(biāo)記，然后在兩個線結(jié)間剪切以獲取竇房結(jié)組織。高亞兵等[12]在做大鼠竇房結(jié)組織切片就是先打結(jié)定位，然后不斷修剪，得到竇房結(jié)組織。雙酶解法即是在打結(jié)定位法的基礎(chǔ)上采用Ⅱ型膠原酶和彈性蛋白酶的無鈣Tyrode液消化，以期在消化后，還能準(zhǔn)確找到含有竇房結(jié)細(xì)胞的組織。殷春霞等[13]的豚鼠竇房結(jié)細(xì)胞分離中使用如上打結(jié)定位+雙酶解法，成功提取竇房結(jié)細(xì)胞。田野等[14]在人胚胎竇房結(jié)細(xì)胞原代培養(yǎng)中，應(yīng)用雙酶解法，不同之處在于，先用較強的0.25%胰酶，再用0.1%的膠原酶作用。而在對照組中，先使用的是0.125%的胰酶。兩者對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者取得較好結(jié)果，值得后來學(xué)者借鑒學(xué)習(xí)。

2.3解剖顯微鏡下分離竇房結(jié)組織，雙酶解法 該方法是指在解剖顯微鏡下，確定竇房結(jié)大致位置，然后使用雙酶解法，消化后準(zhǔn)確提取竇房結(jié)細(xì)胞。高冬學(xué)等[15]乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的原代培養(yǎng)解剖顯微鏡下在上腔靜脈，于界溝中部靜脈竇側(cè)、上腔靜脈部（靜脈開口以上）獲得含有竇房結(jié)細(xì)胞的組織塊。劉如秀等[16]在解剖顯微鏡下于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部取材，后再使用雙酶解法。實驗結(jié)果顯示梭形細(xì)胞所占比例為60%左右，表明該取材方法較為可靠。

2.4以解剖顯微鏡為基礎(chǔ)，用數(shù)碼攝像機(jī)來輔助取材 這種方法是指在解剖顯微鏡的指導(dǎo)下，用數(shù)碼攝像機(jī)記錄獲取組織的全過程。在術(shù)中使用數(shù)碼攝像機(jī)的慢動作放映定位心臟最先開始搏動的位置，可在功能方面保證取材準(zhǔn)確無誤。另外，通過比較切除竇房結(jié)區(qū)前后動物心率的變化以確保完全切取竇房結(jié)組織。使用顯微解剖技術(shù)精確獲取SAN組織，可以避免過多切取非竇房結(jié)心肌細(xì)胞，提高獲取組織中起搏細(xì)胞所占比例。該方法由魏益平在原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞時提出，后暫無類似使用者。

2.5利用心外膜在體竇房結(jié)電圖標(biāo)測 在獲取竇房結(jié)組織之前，用心電圖各電極檢測到特征性“P前波”后，在標(biāo)測電極部位取材。劉啟方等[17]利用以上方法獲取精準(zhǔn)取材后，再結(jié)合雙酶解法對細(xì)胞進(jìn)行提純。而他們設(shè)置的對照組使用的是方法2.1（即按照SAN的解剖學(xué)位置取材）+雙酶解法，觀察結(jié)果經(jīng)對比，兩種取材方法有統(tǒng)計學(xué)意義，即獲得了更多的竇房結(jié)細(xì)胞。

上述五種取材方法，各有利弊。前兩種方法操作起來實用、簡便，可用于病理診斷，但由于無法獲得完整的竇房結(jié)組織，固不適用于精準(zhǔn)的實驗研究。后面三種固然能完整地獲取竇房結(jié)組織，可操作復(fù)雜、費時費力，不宜應(yīng)用于法醫(yī)解剖和司法鑒定，但應(yīng)用于精準(zhǔn)的實驗研究，可大大提高實驗的可信度。

3染色方法的進(jìn)展

3.1光鏡下觀察的染色方法

3.1.1組織切片的制作方法 應(yīng)用普通的組織切片制作流程：固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、表片、烘片等流程制作石蠟切片[15，18，19]。

3.1.2組織切片的染色方法 ①HE染色：脫臘、水化、染核、染質(zhì)、脫水后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察[20-22]。②Masson三色染色：切片脫蠟，然后水化；先用染色，稍沖洗；再用染色，浸洗2次；再用染色，0.25%醋酸水洗2次；最后用脫水，透明，封固切片。在光學(xué)顯微鏡下，用分化，直到心肌纖維清晰為止，并鏡下觀察[12，18，22]。

3.2電鏡下觀察的染色方法 將獲取的組織塊迅速固定（3%戊二醛溶液）、沖洗（0.01 mol/L PBS）、再固定（1%鋨酸溶液）、再沖洗（0.01 mol/L PBS）、梯度脫水（依次通過50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮）、包埋（Epon812）、制作半薄切片、染色（甲苯胺藍(lán)試劑）、在光學(xué)顯微鏡下觀察半薄切片并定位選擇（細(xì)胞小、界限不清、染色淡的細(xì)胞集團(tuán)）、再切片（超薄切片機(jī)切半薄切片）、雙重染色（醋酸鈾和枸櫞酸鉛）、電子顯微鏡下觀察并拍照、記錄[1，7，15，20]。

3.3免疫熒光染色 免疫熒光染色是指在切片制作后，使用熒光物質(zhì)對組織特定部位進(jìn)行染色后，在熒光顯微鏡下觀察的方法。具體舉例如下，培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞，清洗（PBS液）3次，室溫下固定（40 g/L多聚甲醛液）30 min，清洗（PBS）后滴加山羊血清，孵育（37 ℃保溫箱）30～40 min，吸掉液體；滴加超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN）4一抗（按1∶150稀釋），并用PBS做陰性對照。孵育（4 ℃冰箱）過夜，次日清洗（PBS）后滴加山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗（按1∶100稀釋），孵育（37 ℃保溫箱）40 min，清洗（PBS）后封片（緩沖甘油）[4，17，20，21]。張海東等[5]在體內(nèi)外獲取心臟起搏細(xì)胞時，使用了免疫熒光染色的方法。但在染核時使用DAPI試劑，再在熒光倒置顯微鏡觀察；更是使用HCN4來給竇房結(jié)上離子通道做個標(biāo)記。

4觀察技術(shù)的進(jìn)步

隨著科技的發(fā)展，新的顯微鏡的出現(xiàn)，人們觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)也從顯微結(jié)構(gòu)過渡到了亞顯微結(jié)構(gòu)，甚至分子結(jié)構(gòu)。竇房結(jié)細(xì)胞大都一致，可竇房結(jié)的大小、形態(tài)、位置也跟物種有關(guān)。下面有幾種觀察的方法，分別在每種觀察方法后，各舉一例。

4.1光鏡（光學(xué)顯微鏡）觀察 光學(xué)顯微鏡可以觀察到細(xì)胞的外形與微小血管的管壁等結(jié)構(gòu)，故可用來觀察竇房結(jié)的顯微結(jié)構(gòu)。劉穎等[2]在人心竇房結(jié)解剖中觀察到人心竇房結(jié)外形多呈長梭形（或半月形），位于上腔靜脈與右心房交界處的界溝上1/3的心外膜深面，從心外膜表面用肉眼不易辨認(rèn)，結(jié)的長軸與界溝基本平行。竇房結(jié)內(nèi)恒定地有竇房結(jié)動脈穿過其中。竇房結(jié)內(nèi)的細(xì)胞主要有起搏細(xì)胞（pacemakercell）和過渡細(xì)胞（transitionalcell），還有豐富的膠原纖維，形成網(wǎng)裝支架。

4.2電鏡（電子顯微鏡）觀察 電鏡即電子顯微鏡，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，比如核仁、線粒體、高爾基復(fù)合體等亞顯微結(jié)構(gòu)，故可用來觀察竇房結(jié)細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。P細(xì)胞的特點如下：細(xì)胞器少、細(xì)胞核大，核呈圓形或橢圓形，近核膜有染色質(zhì)凝聚，線粒體少，高爾基體發(fā)達(dá)，位于核旁。T細(xì)胞胞的特點：核呈長圓形，線粒體較多，可見較完整的肌節(jié)，細(xì)胞間連接多為中間連接。

4.3熒光生物顯微鏡 熒光生物顯微鏡，利用熒光標(biāo)記物對細(xì)胞膜特定結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，然后有助于觀察膜結(jié)構(gòu)的特點及分布。王志等[20]在乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞原代培養(yǎng)中觀察到梭形細(xì)胞的細(xì)胞膜上分布有HCN4抗原，表現(xiàn)為較連續(xù)的熒光團(tuán)，胞質(zhì)中也有HCN4抗原的分布。三角形細(xì)胞中可見HCN4抗原的表達(dá)，只是數(shù)量不多。

4.4三維立體重建 在光鏡觀察的基礎(chǔ)上，有人應(yīng)用了現(xiàn)代計算機(jī)技術(shù)對竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行了三維立體重建，更加形象地觀察竇房結(jié)的結(jié)構(gòu)。如李鳳霞等[19]使用了Amira 4.1.1 技術(shù)對綿羊竇房結(jié)進(jìn)行三維立體重建，發(fā)現(xiàn)綿羊的竇房結(jié)在外部形態(tài)上與人類及其他哺乳動物存在較大的差異性。

4.5微CT觀察 利用微CT成像技術(shù)對竇房結(jié)的形態(tài)進(jìn)行觀察研究，

5存在的問題與展望

存在的問題：①竇房結(jié)定位取材困難：盡管上述很多方法用于竇房結(jié)取材，可仍因竇房結(jié)位置變異性很大而無法精準(zhǔn)定位取材，無法觀察竇房結(jié)組織在體的情況，以及在體的準(zhǔn)確定位研究；②竇房結(jié)組織獲取困難：實驗中只能在離體的死亡標(biāo)本上獲取竇房結(jié)組織，并不能直接在活體上提取部分竇房結(jié)組織；③竇房結(jié)組細(xì)胞獲得不易：自體竇房結(jié)組織移植治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征目前僅在基礎(chǔ)實驗階段，且自體竇房結(jié)組織獲取不易，而異體竇房結(jié)移植或異種異體竇房結(jié)移植、甚至人工竇房結(jié)移植，因找不到合適的供體還未曾有相關(guān)的文獻(xiàn)記載；④異體竇房結(jié)細(xì)胞植入機(jī)體會產(chǎn)生嚴(yán)重的排斥反應(yīng)：雖然已經(jīng)證實能夠與機(jī)體心肌細(xì)胞建立聯(lián)系，但存活率太低。目前想要應(yīng)用于臨床不現(xiàn)實。

問題是客觀存在的，我們要敢于直面問題，解決問題。期待未來人類能解決上述問題，真正達(dá)到竇房結(jié)移植或替換術(shù)，以徹底解決竇房結(jié)功能結(jié)構(gòu)異常引起的心臟病。

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收稿日期：2017-12-8；收稿日期：2018-2-1

編輯/楊倩