王潤秀 汪國平 曹春瑜 李偉松 謝富華

[摘要]目的 探討姜黃素（Cur）對環(huán)孢素A（CsA）而致的大鼠腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制。方法 將18只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（Ctrl組，n=6）、CsA組（n=6）和CsA+Cur組（n=6），分別給予橄欖油、CsA、CsA聯(lián)合Cur處理。通過測量大鼠的體重、取血測尿素氮和肌酐、腎組織病理學(xué)檢查等指標(biāo)觀察Cur對動物腎間質(zhì)纖維化的改善作用。通過檢測大鼠腎組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量反映其ROS水平。采用分子生物學(xué)方法檢測腎組織轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的表達(dá)情況。結(jié)果 CsA組動物相對于Ctrl組，體重下降（P<0.05），血尿素氮和肌酐水平顯著上升（P<0.05），腎組織TGF-β表達(dá)上調(diào)（P<0.05），ROS水平上升，病理學(xué)表現(xiàn)為輕度間質(zhì)纖維化，但同時給予Cur可以在一定程度上緩解上述表現(xiàn)。結(jié)論 Cur對CsA而致的大鼠腎間質(zhì)纖維化具有一定的保護(hù)作用，其分子機(jī)制可能是降低體內(nèi)ROS水平和下調(diào)TGF-β表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]姜黃素；環(huán)孢素A；腎間質(zhì)纖維化

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）5（b）-0009-04

Protective effect of Curcumin on the renal interstitial fibrosis of rat by Cyclosporin A

WANG Run-xiu1 WANG Guo-ping1 CAO Chun-yu1 LI Wei-song2 XIE Fu-hua3

1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；3.Experimental Teaching Center for Analysis and Testing，Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To investigate the protective effects of Curcumin （Cur） on the renal interstitial fibrosis induced by CsA and reveal the underlying molecular mechanisms.Methods 18 SD rats were randomly divided into control group （Ctrl group，n=6），CsA group （n=6） and group CsA+Cur group （n=6） and the above-mentioned groups was treated with olive oil，CsA and CsA combined with Cur respectively.The effect of Cur on renal interstitial fibrosis in rats were observed by measuring body weight，blood urea nitrogen and creatinine，and histopathological examination.The level of ROS was detected by detecting SOD activity and MDA content in rat kidney tissue.The expression of transforming growth factor beta （TGF-β） in renal tissue was detected by molecular biology.Results Compared with ctrl group，weights of rats in CsA group decreased obviously （P<0.05），and the level of blood urea nitrogen and creatinine increased significantly （P<0.05），and the expression of TGF-β increased significantly （P<0.05）.The level of ROS increased， and the pathological findings were mild interstitial fibrosis.However，giving Cur at the same time could alleviate the above symptoms to some extent.Conclusion Cur has a some protective effect on the renal interstitial fibrosis which induced by CsA，and its molecular mechanism may be down-regulating the expression of TGF-β and the level of ROS.

[Key words]Curcumin；Cyclosporin A；Renal interstitial fibrosis

環(huán)孢素A（CsA）在各種腎臟疾病如難治性腎病綜合征、自身免疫性疾病、各種器官移植或骨髓移植術(shù)后應(yīng)用廣泛，它能顯著延緩慢性腎臟病的進(jìn)展，改善患者的生活質(zhì)量并延長生命[1-5]。然而，長期和廣泛使用CsA卻會所造成腎臟的慢性結(jié)構(gòu)性損害即腎間質(zhì)纖維化[6-7]。不過，近來有研究表明，從姜黃中提取的酚類物質(zhì)姜黃素（curcumin，Cur）具有清除氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、抗纖維化、抗細(xì)胞增殖和抗炎等作用，不僅對缺血再灌注腎損害、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腎損害等均具有很好的保護(hù)作用，而且長期應(yīng)用無明顯毒副作用[8-10]。超氧化物歧化酶（SOD），廣泛存在于動植物組織細(xì)胞中，是重要的生物抗氧化系統(tǒng)。丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)氧自由基作用于脂質(zhì)的代謝產(chǎn)物，檢測組織中SOD活性和MDA水平可間接反映其ROS水平的高低[11-12]。本研究探討Cur是否對CsA引起的腎間質(zhì)纖維化具有保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SD大鼠，共18只，購自贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，平均體重約300 g，雌雄各半，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.2 藥品與試劑

橄欖油：Bellina蓓琳娜牌，購自普通超市。CsA膠囊：50 mg/粒，華北制藥股份有限公司，H10960008，以橄欖油稀釋成相應(yīng)濃度灌胃給藥。姜黃素：國藥集團(tuán)，DMSO助溶后以橄欖油稀釋成相應(yīng)濃度灌胃給藥（DMSO濃度<0.2%）。SOD活性和MDA含量檢測試劑盒購自索來寶生物有限公司。RNA提取試劑Trizol購自天根生物科技有限公司。引物合成于上海生工生物工程有限公司。anti-TGF-β和anti-Actin抗體購自美國SantaCruze公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組、藥物處理和指標(biāo)檢測 18只SD大鼠購進(jìn)并飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組：Ctrl組6只，以橄欖油 30 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃 24 d；CsA組6只，以CSA 30 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃24 d；CsA+Cur組6只，同時以CSA 30 mg/（kg·d）和姜黃素200 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃24 d。每次給藥前對大鼠的體重進(jìn)行稱量，并將每隔3 d的數(shù)據(jù)繪制成動物體重變化圖；給藥結(jié)束后1 d采集大鼠尾靜脈血清采用全自動生化分析儀測定血清尿素氮和肌酐水平。

1.3.2 腎組織病理學(xué)檢測 給藥結(jié)束后脫頸椎處死所有動物，將腎臟摘下后，去除包膜，長軸方向?qū)η校〔糠纸M織行4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，切片厚 4 μm。切片常規(guī)行常規(guī)染色，光鏡觀察。染色切片用高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.3大鼠腎組織SOD活性及MDA含量檢測 稱取適量大鼠腎組織，按每0.1 g加1 ml組織提取液制成組織勻漿，測定組織蛋白濃度（Cpr）后嚴(yán)格按照各試劑盒說明書的方法進(jìn)行黃嘌呤氧化酶法測定組織SOD活性，硫代巴比妥酸法測定組織MDA含量。按下列公式計算組織SOD活性和MDA含量：SOD活性（U/mg prot）=11.11×稀釋倍數(shù)×[（A560空白管-A560測定管）/A560測定管]÷Cpr；MDA含量（nmol/mg prot）=25.8×（A532-A600）÷Cpr。

1.3.4大鼠腎組織分子生物學(xué)檢測 用藥結(jié)束后，各取部分腎組織剪成2小份，液氮速凍。其中1份采用Trizol法提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）mRNA表達(dá)情況，TGF-β上下游引物序列分別為5′-GTAACGGAGTGGTGCGCCAA-3′和5′-TTGCACTTCATCCGCGTCTAGA-3′；以GAPDH作為內(nèi)參基因，其上下游引物序列分別為5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′和5′-CCAAAG TTGTCATGGATGACCT- 3′。另一份稱重后加液氮在冰上研磨成粉末，加入RIPA裂解液（含cocktail）冰上裂解30 min，4℃ 12 000 r/min，離心10 min，取上清100℃變性10 min，各組任選2個樣品蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，4℃孵育抗體過夜，洗膜后孵育二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemilumine-scence，ECl）顯色曝光。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

為減小觀察誤差，采用3次測量取平均值作為最終觀測值的方法。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用SNK法進(jìn)行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)（α）=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Cur對大鼠體重和腎功能的影響

2.1.1體重的變化 CsA組大鼠在使用CsA后第4天開始直至給藥結(jié)束期間，其體重相對于Ctrl組和CsA+Cur組均有所下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但CsA+Cur組大鼠的體重變化相對于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

2.1.2血尿素氮和肌酐的變化 給藥結(jié)束后，CsA組大鼠的尿素氮和血肌酐相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠的尿素氮和血肌酐相對于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2 大鼠腎臟組織病理學(xué)變化

Ctrl組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，CsA組可見腎小球毛細(xì)血管袢開放減少，近曲小管上皮細(xì)胞細(xì)胞水腫，偶可見空泡變性和溶解，壞死，小管輕度萎縮。間質(zhì)單個核細(xì)胞散在或灶性浸潤，有輕度腎間質(zhì)纖維化。而應(yīng)用姜黃素保護(hù)組即CsA+Cur組的上述病變均有所減輕。

2.3 大鼠腎組織SOD活性及MDA含量

與Ctrl組比較，CsA組的大鼠腎臟組織中SOD活性下降和MDA水平升高，即組織中ROS水平升高（P<0.05），而給予Cur可降低動物腎組織中的ROS水平（表2）。

2.4 大鼠腎組織TGF-β表達(dá)的檢測

CsA組大鼠腎組織TGF-β mRNA表達(dá)量相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠腎組織TGF-β mRNA表達(dá)量相對于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

免疫印跡結(jié)果：CsA組大鼠腎組織TGF-β 蛋白表達(dá)量相對于Ctrl組和CsA+Cur組顯著上升，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而CsA+Cur組大鼠腎組織TGF-β 蛋白表達(dá)量相對于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義有（P>0.05）（圖3）。結(jié)果表明：蛋白水平的變化與上述mRNA水平的變化基本吻合。

3討論

CsA 導(dǎo)致慢性腎纖維化發(fā)生的因素較多，其發(fā)生機(jī)制也較復(fù)雜。①CsA可直接或間接促進(jìn)促纖維化因子如TGF-β[13-14]、活性ROS[15-16]、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[17]、單核細(xì)胞超化蛋白-1（MCP-1）[18]和骨橋蛋白（OPN）[19]等的表達(dá)上調(diào)。②CsA可激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS），從而改變腎臟血液動力學(xué)[20]。③腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）及內(nèi)皮素的產(chǎn)生過多、Toll 樣受體（TLR）及上皮細(xì)胞鈉通道異常等因素也參與了CsA 慢性腎纖維化的發(fā)生[5，15，21]。

然而，在上述眾多因素中，TGF-β和ROS扮演了非常重要的角色。TGF-β是最強(qiáng)的致纖維化因子之一，在組織器官纖維化過程中有重要作用。TGF-β主要通過 Smad 信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)：促進(jìn)膠原以及纖維連接蛋白、層黏蛋白等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的大量產(chǎn)生[13，22]；降低金屬蛋白酶表達(dá)，抑制 ECM 降解；激活炎癥反應(yīng)，加重腎臟損害；促進(jìn)EMT的發(fā)生，后者可以大量合成ECM。CsA的長期使用還可引起腎血管病變導(dǎo)致腎組織灌注不足，缺氧缺血誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。反過來，產(chǎn)生的ROS又加重了腎小管上皮細(xì)胞的損傷，使其表型改變，發(fā)生EMT或凋亡。

Cur是中藥姜黃中提取的一種酚類物質(zhì)，已有研究表明，Cur對缺血再灌注腎損害、糖尿病腎病、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腎損害、阿霉素所致的腎損害等均具有保護(hù)作用，不僅具有清除ROS、抗纖維化、抗細(xì)胞增殖、抗炎等性質(zhì)，而且長期應(yīng)用無明顯毒副作用。近來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Cur能使單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的TGF-β表達(dá)明顯減低，能刺激保護(hù)胞內(nèi)酶途徑ROS的生成及可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的ROS的水平，從而具有抗氧化特性。

本研究表明，應(yīng)用CsA可導(dǎo)致動物體重下降，腎功能減低，腎臟輕度間質(zhì)纖維化。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)CsA導(dǎo)致腎臟纖維化與TGF-β表達(dá)上調(diào)和ROS水平升高有關(guān)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果一致。Cur的聯(lián)合使用則可改善動物的機(jī)體狀態(tài)、保護(hù)腎功能和改善腎組織纖維化程度，其可能的分子機(jī)制是通過下調(diào) TGF-β表達(dá)和降低體內(nèi)的ROS水平實現(xiàn)的，但具體的信號通路有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-03-08 本文編輯：許俊琴）