齊悅 朱濤 覃志成

[摘要]目的 觀察核因子κB受體活化因子配體（RANKL）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的人腎足細胞分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）的影響，探究AngⅡ是否通過RANK/RANKL信號通路影響足細胞表達VEGF。方法 以分化為樹枝狀的人腎足細胞為研究對象，以不同濃度（0、1、10、100 nmol/L）的AngⅡ處理，分別于不同時間（0、6、12、24 h）通過實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測基因VEGF、RANK和RANKL的mRNA表達變化。然后以不同劑量的RANKL與100 nmol/L AngⅡ共同刺激足細胞24 h后，通過RT-PCR檢測VEGF的mRNA表達變化，流式細胞術(shù)檢測足細胞凋亡率變化。結(jié)果 AngⅡ呈劑量和時間依賴性地誘導(dǎo)足細胞表達VEGF、RANK和RANKL（P<0.05），而過量RANKL表現(xiàn)出劑量依賴性地阻斷VEGF表達增高 （P<0.05）；與對照組比較，AngⅡ可以顯著誘導(dǎo)足細胞凋亡（P<0.05），而RANKL可以抑制由AngⅡ誘導(dǎo)的足細胞凋亡（P<0.05）。結(jié)論 AngⅡ可能通過RANK/RANKL信號通路影響足細胞表達VEGF，RANKL通過反饋調(diào)節(jié)下調(diào)VEGF基因表達來抑制AngⅡ引起的足細胞凋亡，保護腎臟。

[關(guān)鍵詞]足細胞；血管緊張素Ⅱ；核因子κB受體活化因子配體；血管內(nèi)皮細胞生長因子

[中圖分類號] R692.6 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）5（b）-0013-05

Effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand on the secretion of vascular endothelial cell growth factor from human glomerular podocytes induced by angiotensinⅡ

QI Yue1 ZHU Tao2 QIN Zhi-cheng3

The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） on the secretion of vascular endothelial growth factor （VEGF） induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in human renal podocytes，and to explore whether AngⅡaffecting VEGF expression in podocytes through RANK/RANKL signaling pathway.Methods The human renal podocytes differentiated into dendrites were selected as research subjects.They were dealt with AngⅡin different concentrations （0，1，10，100 nmol/L）.Real-time fluorescence quantitative PCR was performed at different time （0，6，12，24 h） to detect the changes in mRNA expression of the genes VEGF，RANK，and RANKL.Then podocytes were stimulated with different doses of RANKL and 100 nmol/LM AngⅡ for 24 h.The expression of VEGF mRNA was detected by RT-PCR and the apoptosis rate of podocytes was detected by flow cytometry.Results AngⅡ induced podocyte expression of VEGF，RANK，and RANKL in a dose-and time-dependent manner （P<0.05），while excess RANKL showed dose-dependent blockade of VEGF expression increasing （P<0.05）.Compared with the control group，AngⅡ significantly induced podocyte apoptosis （P<0.05），while RANKL inhibited podocyte apoptosis induced by AngⅡ （P<0.05）.Conclusion AngⅡ may affect podocyte expression of VEGF through RANK/RANKL signaling pathway.RANKL inhibits the apoptosis of the podocytes induced by AngⅡ by regulating the expression of VEGF gene through feedback regulation and protects the kidneys.

[Key words]Podocyte；Angiotensin Ⅱ；Receptor activator of nuclear factor-κB ligand；Vascular endothelial growth factor

足細胞（腎小球臟層上皮細胞，podocyte）作為腎小球的濾過屏障的重要組成部分，在多種因素的刺激下可導(dǎo)致其損傷，從而引起蛋白尿的發(fā)生和腎小球的硬化[1]。血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ），作為腎臟局部腎系血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）的主要效應(yīng)因子， 在間充質(zhì)干細胞、小鼠和人足細胞等多種細胞中能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）表達上調(diào)，p-38、Akt、ERK可能發(fā)揮著重要作用[2-5]。但AngⅡ與VEGF在人足細胞中的作用機制仍有許多不明之處還需進一步研究。

Liu等[6]的研究發(fā)現(xiàn)一條和炎癥相關(guān)的新信號通路介導(dǎo)足細胞損傷，即腫瘤壞死因子家族的核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信號，RNAK的配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）可以阻抑凋亡，保護足細胞。前期實驗已發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以通過p38MAPK信號通路誘導(dǎo)足細胞表達VEGF[7]，推測在人腎小球足細胞中是否也存在類似AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF的通路，調(diào)節(jié)足細胞的功能，故本實驗擬對AngⅡ誘導(dǎo)足細胞表達VEGF的變化及其與RANK/RANKL信號通路的關(guān)系進行研究，以進一步明確AngⅡ誘導(dǎo)足細胞表達VEGF的作用機制及其對足細胞的保護作用，為將來藥物干預(yù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1% ITS（胰島素10 μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5.5 μg/ml、亞硒酸鈉5 ng/ml，美國Sigma公司）；青霉素（華北制藥）；AngⅡ （美國Sigma公司）；RANKL（美國R&D; Systems公司）； Trizol液（美國Promega公司）；引物 （上海生工公司）；RNA 提取試劑盒 （美國Omega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prie Script TMRT-PCR kit，寶生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（寶生物工程有限公司）；實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.2 足細胞培養(yǎng)

人腎小球足細胞由英國Bristol大學(xué)Saleem教授贈送，按參考文獻[8]的方法培養(yǎng)。足細胞復(fù)蘇后在含1% ITS的RPMI-1640培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中，于33℃ 、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含0.05%胰蛋白酶的消化液消化傳代，然后轉(zhuǎn)入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分化14 d。選取在37℃條件下分化為樹枝狀的人腎足細胞為研究對象。

1.3實驗分組

AngⅡ濃度梯度對人腎小球足細胞表達基因VEGF、RANK和RANKL的影響：細胞各組中分別加入AngⅡ，其終濃度分別為0、1、10、100 nmol/L，培養(yǎng)24 h后收集細胞。AngⅡ時間梯度對人足細胞VEGF、RANK和RANKL基因表達的影響：用100 nmol/L AngⅡ影響VEGF基因表達的最佳濃度干預(yù)細胞，分別培養(yǎng)0、6、12、24 h。RANKL對AngⅡ誘導(dǎo)人腎小球足細胞表達VEGF的影響：用AngⅡ（100 nmol/L）加入不同劑量的RANKL（0、20、40、80 ng/ml）干預(yù)足細胞24 h，同時設(shè)置正常組（不加AngⅡ和RANKL）。

1.4 RNA提取和半定量RT-PCR

用Trizol法提取總RNA進行RT-PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法進行相對定量。嚴(yán)格按照RT-PCR相關(guān)試劑盒說明書進行操作，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在Roche 480儀器上進行PCR檢測。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s（35 cycles）。各基因引物序列見表1。

1.5 AngⅡ和 RANKL干預(yù)對足細胞凋亡率的影響

實驗分三組：分別以100 nmol/L 的AngⅡ單獨刺激足細胞，100 nmol/L的AngⅡ和80 ng/ml的 RANKL共同處理足細胞24 h，同時設(shè)置空白對照組。胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞2次，使用凋亡檢測試劑盒進行FITC和PI雙染15 min，30 min內(nèi)通過流式細胞儀測定細胞凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way AVONA）和Turkey檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量AngⅡ?qū)θ四I足細胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表達水平的影響

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，以不同濃度AngⅡ刺激腎足細胞24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表達均呈劑量依賴性升高。如圖1所示，與空白組比較，較大劑量組（10、100 nmol/L AngⅡ）的VEGF、RANK和RANKL mRNA表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 AngⅡ刺激不同時間對人腎足細胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表達水平的影響

在AngⅡ（100 nmol/L）刺激腎足細胞0、6、12、24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表達均呈時間依賴性升高。與對照組（0 h）比較， VEGF、RANK和RANKL mRNA表達量均隨干預(yù)時間增加而呈現(xiàn)明顯的上升趨勢（P<0.05）（圖2）。

2.3 RANKL對經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的足細胞表達VEGF的影響

與空白組比較，經(jīng)AngⅡ 100 nmol/L刺激，不添加RANKL的對照組的VEGF mRNA表達增加（P<0.01）。經(jīng)RANKL干預(yù)的足細胞，VEGF mRNA的表達受到抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性抑制。小劑量組（20 ng/ml）與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。但隨著RANKL劑量的增大，VEGF mRNA表達明顯下調(diào)（P<0.05）（圖3），提示在AngⅡ誘導(dǎo)的足細胞中，RANKL影響mRNA的表達，與VEGF mRNA的表達成負(fù)相關(guān)。

2.4 AngⅡ和 RANKL干預(yù)對足細胞凋亡率的影響

收集細胞，使用BD Accuri C6流式細胞儀進行細胞凋亡率檢測，并進行方差分析。與空白組（0.4±0.1）%比較，對照組（AngⅡ 100 nmol/L）的凋亡率為（28.34±2.2）%，說明AngⅡ可以明顯誘導(dǎo)足細胞凋亡。AngⅡ+RANKL組的細胞凋亡率為（11.14±1.06）%，與AngⅡ比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4），提示RANKL可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的足細胞凋亡。

3 討論

蛋白尿是幾乎所有腎小球疾病的共同臨床表現(xiàn)之一，它不僅是腎小球濾過屏障受損的標(biāo)志，而且它與腎小球疾病的進展密切相關(guān)，是腎小球疾病進展的獨立危險因素。足細胞是附著在腎小球基底膜（GBM）外側(cè)高度分化的細胞[9]，作為腎小球固有細胞之一，連同GBM和毛細血管內(nèi)皮細胞一起，構(gòu)成腎小球血液濾過屏障[10]。作為血液濾過的最后屏障，足細胞已經(jīng)成為針對蛋白尿研究的關(guān)鍵細胞。目前大量研究認(rèn)為，足細胞損傷是腎小球損傷的中心環(huán)節(jié)，可以直接導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生及腎小球的硬化。因此，研究足細胞從而揭示蛋白尿發(fā)生的機制具有重要意義。

VEGF是一種二聚體糖蛋白，是內(nèi)皮特異性的有絲分裂原，在腎臟主要表達于足細胞的足突，有增加血管通透性、促進內(nèi)皮細胞增生和血管形成作用。而VEGF受體則以跨膜蛋白的形式表達于腎小球內(nèi)皮細胞表面，足細胞可以通過旁表達的方式調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，是內(nèi)皮細胞重要的調(diào)控因子[11]。腎小球足細胞和內(nèi)皮細胞是構(gòu)成濾過膜的重要成分，VEGF能減少GBM陰離子數(shù)而影響電荷屏障，并通過影響腎小球內(nèi)皮細胞而調(diào)節(jié)機械屏障，因而VEGF被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腎小球通透性的重要因子，在腎病進展中扮演著重要的角色[12]。大量證據(jù)表明，VEGF與蛋白尿的形成密切相關(guān)[13]，VEGF的異常表達增加可導(dǎo)致腎小球濾過膜通透性增加，促進蛋白尿的形成。

腎臟局部的RAS在慢性腎臟病變的發(fā)生發(fā)展中的重要作用越來越受到人們的關(guān)注，RAS的主要效應(yīng)因子AngⅡ 與許多腎臟疾病的發(fā)展過程密切相關(guān)[14-15]。研究表明，AngⅡ可以誘導(dǎo)腎臟內(nèi)生性VEGF的產(chǎn)生[5]。此外，Ren等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ以劑量依賴方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的足細胞以及動物模型足細胞凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可以誘導(dǎo)足細胞凋亡，但是過量的RANKL會抑制AngⅡ誘導(dǎo)的足細胞凋亡。足細胞作為血液濾過的最后屏障，其凋亡必然會增加腎小球濾過膜的通透性，引起蛋白尿的形成。因此，維持VEGF正常水平和足細胞的數(shù)量，可以保護腎小球，避免蛋白尿的發(fā)生。

RANK及其RANKL是腫瘤壞死因子（TNF）及其受體超家族的成員。以往對RANK和RANKL的研究主要集中在骨質(zhì)疏松及骨腫瘤性疾病中。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RANK/RANKL/OPG通路是成骨細胞和破骨細胞之間進行對話的重要信號通路， RANKL結(jié)合RANK后通過調(diào)控NF-κB和MAPK通路促進破骨細胞的分化與活化引起骨質(zhì)的破壞[17]。近年有研究表明，RANK和RANKL參與慢性腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。Liu等[6，18]在腎小球硬化性腎病、IgA腎病、膜性腎病等患者腎臟中發(fā)現(xiàn)RANK和RANKL的高表達，且RANK特異性表達于足細胞。Chen等[19]體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，RANK和RANKL介導(dǎo)NF-κB通路和MAPK通路活化，促進足細胞損傷，加快腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ以時間和劑量依賴性的上調(diào)VEGF基因的表達，這與Pupilli等[20]的研究結(jié)果類似。此外，AngⅡ還能引起RANK和RANKL基因水平的表達上調(diào)。當(dāng)足細胞中加入過量外源性的RANKL時，VEGF的基因水平表達下調(diào)，最終引起足細胞凋亡率減少。上述兩方面實驗結(jié)果說明，RANKL與VEGF存在直接的相互關(guān)系，處于同一個通路AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF中。當(dāng)AngⅡ含量升高，刺激足細胞表達過多的VEGF，能導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。而AngⅡ還能引起RANK/RANKL的表達升高。但當(dāng)RANKL達到一定濃度后，能下調(diào)VEGF的表達水平，形成反饋調(diào)節(jié)。因此，AngⅡ和RANK/RANKL兩者通過一定的平衡狀態(tài)共同調(diào)節(jié)VEGF的表達，維持腎臟的正常功能。本文的研究提示AngⅡ和RANK/RANKL兩者共同維持VEGF表達水平，避免足細胞凋亡，為將來藥物干預(yù)治療尿蛋白提供了研究基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-03-06 本文編輯：許俊琴）