甘露 鄧之婧 王獻哲 蘇棋 梁聰 郭哲 何萍

[摘要]目的 探討二氫楊梅素（DMY）對小鼠局灶性腦缺血再灌注（I/R）損傷的抗細胞凋亡作用和相關(guān)機制，從而研究DMY抗腦缺血損傷的保護機制。方法 將雄性昆明種小鼠隨機分為假手術(shù)組、I/R模型組及DMY（500 mg/kg）組。小鼠大腦中動脈阻塞/再灌注（MCAO/R）局灶性腦I/R損傷模型利用改良線栓法來進行制備與完善。DMY組術(shù)前連續(xù)灌胃給藥10 d，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次。缺血3 h再灌注24 h后，取腦采用原位缺口末端標記法（TUNEL）進行凋亡檢測，免疫組織化學法和實時熒光定量PCR 法（RT-qPCR）分別檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及B細胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）蛋白及mRNA 表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，在I/R模型組中，小鼠缺血腦組織中凋亡陽性細胞數(shù)量明顯增高，凋亡相關(guān)因子Bcl-2蛋白及基因表達下降（P<0.01），而Bax的蛋白及基因表達增強（均P<0.01）。與I/R模型組比較，DMY組小鼠缺血腦組織凋亡陽性細胞率顯著下降，Bcl-2蛋白及基因表達增強，Bax蛋白和基因表達下降（均P<0.01）。結(jié)論 DMY可減輕小鼠局灶性腦I/R損傷所致的細胞凋亡，其抗凋亡機制可能與DMY上調(diào)Bcl-2表達、下調(diào)Bax表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]二氫楊梅素；腦缺血/再灌注損傷；大腦中動脈阻塞；細胞凋亡

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）5（b）-0004-05

Study on anti-apoptosis effect and mechanism of dihydromyrcetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in mice

GAN Lu1 DENG Zhi-jing1 WANG Xian-zhe1 SHU Qi1 LIANG Cong1 GUO Zhe HE Ping

1.Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530031，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

[Abstracts]Objective To study the anti-apoptosis effect of dihydromyricetin （DMY） on acute focal cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury in mice.Methods Male Kunming mice were randomly divided into sham group，I/R group and DMY group （500 mg/kg）.Mice model of I/R injury was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO） using modified thread method.Daily intragastric administration of DMY was carried out 10 days before the surgery，and 1 hour before ischemia and 12 hours after reperfusion.The brain tissues of the mice were harvested after ischemia for 3 hours and reperfusion for 24 hours.Myocyte apoptosis in the cerebral I/R brain was detected with in situ terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL staining） .The protein and mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry assay and real-time quantitative PCR （RT-qPCR） respectively.Results Compared with sham group，apaotosis index was significantly higher，protein and mRNA expressions of Bcl-2 were lower than those of Bax were higher in I/R model group （all P<0.01）.Compared with I/R model group，in DMY group，apoptosis index decreased significantly，the expressions of Bcl-2 were higher，those of Bax were lower （all P<0.01）.Conclusion DMY can reduce the myocyte apoptosis induced by focal I/R injury，its anti-apoptotic mechanism might be related to regulating the expressionof Bax and Bcl-2.

[Key words]Dihydromyricetin；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Middle cerebral artery occlusion；Apoptosis

腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion injury，I/R）損傷涉及多種病理機制，越來越多的論據(jù)表明，細胞凋亡（apoptosis）在腦I/R損傷中發(fā)揮重要的作用。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種具有多種藥用價值的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DMY對于小鼠急性局灶性腦 I/R損傷，可以起到抗氧化、抗炎的保護作用[2-3]。本研究采用改良線栓法制備小鼠腦I/R損傷模型，觀察DMY對腦I/R損傷后細胞凋亡及凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2蛋白和基因表達的影響，進一步研究DMY對急性腦I/R損傷的抗細胞凋亡的保護作用。

1材料與方法

1.1 實驗動物

體重為25～30 g的SPF級雄性昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供并有合格證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要藥品與試劑

DMY（購于西安開來生物工程有限公司，純度98.33%，批號K130311），臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配成50 mg/ml混懸液。異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批號217151201）。原位缺口末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒（Roche，瑞士）。兔抗鼠Bax和Bcl-2一抗（北京博奧森）；SP免疫組化檢測試劑盒（北京中杉）；β-actin、Bax和Bcl-2引物（Takara）；RNAiso Plus Total RNA 提取試劑盒，PrimeScript TMRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBRRPremix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒（Takara）。

1.3主要儀器設(shè)備

R580動物麻醉機（瑞沃德生命科技有限公司）；XTZ-D體式顯微鏡（上海光學五廠）；DMR+Q550病理圖像分析儀（德國Leica）；7300實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4動物分組和給藥方法

42只昆明小鼠隨機分成3組，即動物假手術(shù)組、I/R動物模型組和DMY（500 mg/kg）組，每組14只。DMY組在造模前，每天1次，連續(xù)10 d相同時間段，灌胃給予DMY 500 mg/kg，而后在缺血前1 h給藥1次，再灌注后12 h再灌胃1次；動物假手術(shù)組和I/R動物模型組相同時間段灌胃等同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.5小鼠局灶性腦I/R損傷模型制備

局灶性腦I/R模型通過改良線栓法建立和完善[4]。準備好解剖顯微鏡和器械，麻醉后鏡下小心剪開頜骨下皮膚并利用微型剪慢慢剝離，在靠近氣管旁找到左頸總動脈，完全剝離出至少3 cm的長度，而后先在動脈下先穿過3根結(jié)扎線，最下邊的線結(jié)扎靠近近心端的動脈段，最上邊的線放在最遠離心臟的動脈端，利用微型剪在動脈中間位置剪開約1/2大小的口子，開始插入帶有硅膠潤滑頭部的線栓（直徑為0.20～0.23 mm）約0.6 cm后，稍改變方向后再插入0.2～0.3 cm后用預先放好的結(jié)扎線固定。在缺血3 h后，利用同法撥出線栓后結(jié)扎頸總動脈，經(jīng)過24 h缺血再灌注后行多聚甲醛灌注取腦。假手術(shù)組鏡下小心分離并結(jié)扎左頸總動脈，不需要插線栓。

1.6 TUNEL法測凋亡

腦細胞凋亡再灌注24 h后，每組取6只小鼠，用4%多聚甲醛灌注心臟至全身后取腦，繼續(xù)放于多聚甲醛中固定24 h以上。取缺血區(qū)腦組織約3 mm大小進行酒精梯度濃度脫水，用石蠟法包埋好組織，以切片機切出每張厚度為4 μm的薄切片。進行蘇木精-伊紅染色后，在光學顯微鏡下觀察腦組織缺血灶的病理性變化；根據(jù)TUNEL試劑盒步驟和方法進行腦組織的細胞凋亡染色。每只小鼠隨機挑選缺血腦組織的周邊區(qū)4個互不重疊的400倍高倍視野，分別對細胞核總數(shù)和凋亡細胞核數(shù)計算，并計算凋亡陽性細胞率（%）。凋亡陽性細胞率（%）=（凋亡陽性細胞數(shù)/總計數(shù)的細胞數(shù)）×100%。凋亡陽性細胞數(shù)和總計數(shù)的細胞數(shù)由病理圖像分析儀分析計算。

1.7免疫組織化學法測定蛋白表達

按試劑盒說明書進行腦Bax和Bcl-2蛋白免疫組織化學染色。每只小鼠缺血腦組織周邊區(qū)隨機選4個互不重疊、互不干擾的400高倍視野，并由軟件分析Bax和Bcl-2陽性細胞百分比（%）。

1.8 RT-qPCR測定腦Bax和Bcl-2 mRNA的基因表達

再灌注24 h后，每組另取8只小鼠，取小鼠缺血側(cè)腦組織進行勻漿，按照試劑盒說明抽提總RNA后，由核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度和純度。對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得產(chǎn)物cDNA，之后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 預變性5 min；94℃ 變性30 s，35℃ 退火35 s，72℃ 延伸1 min，反應(yīng)40個循環(huán)，設(shè)內(nèi)參β-actin進行標化。結(jié)果分析以2-ΔΔCt法計算相應(yīng)的mRNA表達水平，即以目的基因的Ct值與β-actin的Ct值的差值ΔCt，計算2-ΔΔCt =2-（ΔCt 實驗組-ΔCt 對照組），作為相對含量進行分析?；蛞镄蛄斜硪姳?。

1.9統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所有計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 DMY對小鼠腦組織缺血周邊區(qū)細胞凋亡的影響

鏡下觀察，TUNEL陽性凋亡細胞的胞核呈現(xiàn)出棕褐色。凋亡陽性細胞率測定結(jié)果表明，假手術(shù)組幾乎無TUNEL陽性細胞表達[（8.67±2.08）%]。與假手術(shù)組比較，I/R模型組TUNEL陽性細胞數(shù)量[（80.33±5.50）%]明顯增加（P<0.01）；而DMY組中TUNEL陽性細胞數(shù)量[（31.00±3.61）%]較I/R模型組顯著減少（P<0.01）。結(jié)果見圖1、圖2。

Bcl-2陽性染色主要位于胞質(zhì)。假手術(shù)組可見大量陽性面積表達[（71.00±6.04）%]，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2陽性細胞數(shù)量[（30.40±3.51）%]減少（P<0.01）；與而與I/R模型組比較，DMY能明顯增加Bcl-2陽性細胞數(shù)量[（46.60±2.07）%]（P<0.01）。結(jié)果見圖5、圖6。

2.3 DMY對小鼠缺血腦組織Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

進行相對表達量計算后可得，與假手術(shù)組[（0.97±0.03）倍]比較，I/R模型組的Bax mRNA表達量[（10.81±1.62）倍]明顯上調(diào)（P<0.01）；與I/R模型組比較，DMY組顯著下調(diào)Bax mRNA表達量[（5.65±0.37）倍]（P<0.01）。在I/R模型組中Bcl-2 mRNA表達量[（0.10±0.01）倍]較假手術(shù)組[（1.02±0.03）倍]明顯降低（P<0.01）；與I/R模型組比較，DMY組Bcl-2 mRNA表達量[（0.29±0.51）倍]顯著增加（P<0.01）。結(jié)果見圖7。

3討論

本研究在建立小鼠大腦I/R損傷模型的基礎(chǔ)上觀察DMY對小鼠局灶性腦缺血再灌注后抗細胞凋亡的保護機制。腦缺血再灌注損傷之后可引起以細胞凋亡為主要機制的炎癥損傷[5]。腦缺血后，細胞在形態(tài)上表現(xiàn)皺縮，細胞間隙加大并脫離，密度增加引起通透性改變，核質(zhì)濃縮，核膜核仁發(fā)生破裂。腦缺血再灌注后，主要通過缺血細胞中的鈣離子沉積、氧化應(yīng)激、線粒體因素來誘導細胞凋亡的啟動[6]。通過TUNEL染色后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)出現(xiàn)明顯細胞固縮變形，體積變小，核染色質(zhì)呈現(xiàn)邊集化，與相關(guān)文獻的研究結(jié)果一致[7]。腦I/R損傷后，缺血區(qū)細胞凋亡數(shù)量明顯增多，而DMY可以減少缺血區(qū)細胞凋亡的數(shù)量。研究結(jié)果提示DMY可通過抗凋亡作用保護腦I/R損傷。

炎癥反應(yīng)直接參與損傷細胞的同時又可通過線粒體介導的內(nèi)源性途徑[8]、細胞表面的死亡受體如Fas和腫瘤壞死因TNF-R引發(fā)的外源性途徑[9-10]等誘導細胞凋亡間接導致?lián)p傷。在腦血管疾病中，細胞中線粒體功能急性紊亂是首先發(fā)生的，也是基本的因素[11]。腦缺血再灌注損傷主要涉及線粒體功能的障礙和衰竭，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裂解和超微結(jié)構(gòu)損傷，導致細胞主要通過內(nèi)源性途徑發(fā)揮凋亡作用，所以內(nèi)途徑通路在缺血再灌注損傷中表現(xiàn)得尤為重要。內(nèi)途徑主要是由Bax和Bcl-2這兩個相互為拮抗的蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來激活胱冬肽酶-3（caspase-3），從而發(fā)揮作用[12]。作為體內(nèi)重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，存活基因Bcl-2的主要作用是抑制細胞凋亡，促凋亡基因Bax則通過作用于線粒體釋放其中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1，使之與Cytc共同激活caspase信號轉(zhuǎn)導途徑。Bax和Bcl-2的比例失衡，使促凋亡因子細胞色素C被釋放到胞質(zhì)中，從而和caspase-9形成復合物后，作為細胞凋亡內(nèi)源性途徑的發(fā)起者，進一步激活下游caspase-3，并且啟動凋亡的過程誘導細胞凋亡[13]。針刺對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的抗細胞凋亡的主要機制是Bcl-2表達上調(diào)和Bax和caspase表達下降[14]；三七總皂苷R1激活Bcl-2的表達以及通過抑制Bax蛋白表達的來減少腦梗死面積，減少細胞凋亡[15]；DMY逆轉(zhuǎn)由3-硝基丙酸誘導的大鼠行為缺陷和紋狀體組織病理損傷，通過誘導Bcl-2的上調(diào)，使細胞凋亡明顯減少[16]。Bcl-2是抑制凋亡因子，所以說Bax和Bcl-2的表達影響著細胞凋亡的發(fā)生，而這不僅僅是體現(xiàn)在腦血管疾病中，在抗腫瘤中的作用也是如此。左彥珍等[17]發(fā)現(xiàn)，DMY可以通過下調(diào)Bcl-2/Bax的比值來促進宮頸癌HeLa 細胞凋亡而起到抗腫瘤作用；DMY還可以通過保護氧化應(yīng)激，下調(diào)半胱氨酸蛋白酶活化和上調(diào)Bcl-2的蛋白表達，誘導骨肉瘤細胞凋亡[18]。綜上所述，細胞凋亡主要依賴內(nèi)源性途徑，Bax和Bcl-2作為介導內(nèi)源性途徑的凋亡相關(guān)因子扮演著重要角色。

本實驗通過免疫組化法測定Bcl-2和Bax的陽性細胞表達，并進一步用熒光定量PCR檢測相關(guān)mRNA表達。通過實驗表明，腦I/R損傷后，I/R模型組Bax蛋白表達和mRNA表達均顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白和mRNA表達均顯著下降，Bax>Bcl-2，說明腦I/R損傷后腦神經(jīng)細胞抗凋亡能力下降，表現(xiàn)為促進凋亡。而在DMY組，DMY明顯抑制Bax上調(diào)，上調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達。由此可知，預先給予DMY能減少腦I/R損傷細胞內(nèi)損傷后細胞內(nèi)Bax/Bcl-2病理性調(diào)控所引發(fā)的凋亡。提示細胞凋亡的早期，線粒體在核染色體DNA還未改變之前就已經(jīng)出現(xiàn)改變，說明其凋亡過程可能有線粒體來完成[19]。以上結(jié)果提示DMY可以通過抑制I/R損傷后的細胞凋亡反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用，機制可能語Bax/Bcl-2介導的凋亡途徑有關(guān)[20]。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明DMY可以減輕神經(jīng)元凋亡，同時下調(diào)Bax蛋白及mRNA表達，上調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達，提示DMY對腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用可能歸因于對抗細胞凋亡，其機制可能與調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡途徑有關(guān)。

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（收稿日期：2018-03-19 本文編輯：許俊琴）