花生黃曲霉毒素污染拮抗菌B25-5的篩選、鑒定及控制效果

杜瑞煥 高素艷 張 誼 姚彥坡

(農業(yè)部農產品質量安全風險評估實驗站；唐山市畜牧水產品質量監(jiān)測中心，唐山 063000)

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉 (A.Flavus) 和寄生曲霉 (A.Parasiticus)產生的強致癌、劇毒性真菌毒素，包括B、G和M族，其中B1最普遍且毒性最強，為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，致癌力為六六六農藥的10 000倍，人或動物食用受毒素污染的農產品和食品后會導致機體病變甚至死亡，嚴重威脅消費者健康與生命安全[1]。黃曲霉毒素主要污染花生、玉米等農產品，給我國農產品和食品安全帶來嚴重威脅[1-2]。因此，消除花生等農產品中黃曲霉毒素污染，減輕其對人畜的不良影響，降低其代謝產物在農產品及畜禽產品中的殘留，保證農產品質量安全，是當前農業(yè)生產研究的熱點之一[3-6]。

花生黃曲霉毒素污染的防控重在源頭治理，目前，防控花生等農產品中黃曲霉菌侵染及毒素污染過程中以化學防治為主。由于化學防治成本較高和易污染環(huán)境，而且產毒黃曲霉易對殺菌劑產生抗藥性，所以，尋找一種對人畜健康、對環(huán)境友好的控制措施勢在必行[7-8]。花生莢果內拮抗細菌分布廣、種類多、數量大，在長期進化過程中，與作物建立了密切關系，其中有些細菌具有抑制病原菌、促進植物生長、增強植株抗逆性、增殖和擴散快等優(yōu)點，因而成為發(fā)展前景很好的病原微生物生防菌[8]。本文以產毒黃曲霉及毒素為研究對象，從花生中分離有益微生物，并采用活體方法篩選拮抗細菌，研究拮抗菌的抗菌活性，以期探索解決花生黃曲霉毒素污染的防控瓶頸問題途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

產毒黃曲霉由中國農業(yè)科學院油料作物研究所質標室/農業(yè)部生物毒素檢測重點實驗室提供。有益微生物從采自河北省灤南、灤縣、遷西、遷安、玉田及豐南等主產區(qū)縣的健康花生莢果中分離獲得。

1.2 花生中細菌的分離、純化與保存

花生中細菌的分離參照Dey等[7]的方法。選取上述區(qū)縣主產區(qū)的花生莢果，帶回實驗室分離。在超凈工作臺中將花生莢果用1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用無菌水沖洗5次，瀝干水分。用研缽研碎后放置于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長狀況，并及時挑取特征差異明顯、分離良好的單菌落，進一步純化獲得純菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保藏備用。

1.3 產毒黃曲霉拮抗細菌的離體篩選

采用對峙培養(yǎng)法對黃曲霉拮抗細菌進行篩選。將預先準備好的黃曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫滅菌的牙簽蘸取內生細菌，等距離(距病原菌2 cm處)對稱點接到PDA平板上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)，3～7 d觀察抑菌帶的有無及大小，重復3次。選出抑菌帶大于5 mm的內生細菌菌株在花生仔仁上進行復篩及計算抑制率。抑制率=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100%。

1.4 產毒黃曲霉拮抗細菌的活體篩選

1.4.1 拮抗菌發(fā)酵液的準備：用挑針挑取離體實驗中具有抑菌活性的拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。吸1 mL培養(yǎng)液轉接至裝有50 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，獲得拮抗菌株的發(fā)酵液。

1.4.2 拮抗細菌的活體篩選：把發(fā)酵2 d的拮抗菌發(fā)酵液(孢子最終濃度為3.0×106孢子/mL)和培養(yǎng)7 d生長旺盛的黃曲霉菌菌懸液(孢子最終濃度為3.0×106孢子/mL-1)分別浸泡花生莢果30 min，陰涼處被干后放入無菌平板，每板20?；ㄉ腥?，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，濕度70%～80 %，光照為12 h黑暗，12 h光照。以不浸菌液為空白對照，每處理設3次重復。

1.5 拮抗菌B65-2對產毒黃曲霉的抑制作用

1.5.1 上清液和過濾液制備：生防菌B65-2在LB斜面上活化后，取一環(huán)于LB培養(yǎng)液中，100 mL/300 mL裝液量，37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，制備成以下處理液：上清液：培養(yǎng)液在120 00 r/min下離心15 min，取上清，用0.22 μm細菌過濾器過濾后得到無菌的過濾液。

1.5.2 菌懸液制備：培養(yǎng)液在12 000 r/min下離心15 min，棄上清，菌體用無菌水清洗3次再離心，加入無菌水。

1.5.3 蛋白粗提液：培養(yǎng)液于4 ℃下12 000 r/min離心15 min棄沉淀，在上清液中加固體硫酸銨至70%飽和度，4 ℃靜置過夜，于4 ℃下10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用1/25體積10 mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液懸浮，然后用0.22 μm細菌過濾器過濾可能存在的細菌。

1.5.4 生防菌代謝產物對黃曲霉孢子萌發(fā)的影響：產毒黃曲霉的孢子濃度調整為1×106個/mL，與終濃度為1×107個/mL的拮抗菌混合培養(yǎng)于 PD 液體培養(yǎng)基中(以不加拮抗菌為對照)，置于28 ℃搖床培養(yǎng)。分別于培養(yǎng) 8、16、24 h 后顯微鏡觀察黃曲霉孢子萌發(fā)情況。每個處理隨機觀察 200 個黃曲霉孢子，計算孢子萌發(fā)率。實驗重復 3 次。

1.5.5 拮抗菌抑制黃曲霉菌絲生長及黃曲霉毒素產生的研究：用上述制備好的上清液、過濾液及蛋白粗提液培養(yǎng)黃曲霉，以測定其對黃曲霉生長和產毒的影響，28 ℃ 霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d 后，培養(yǎng)液經 Beacon 黃曲霉毒素固相萃取柱純化后，用 LC-MS / MS 檢測黃曲霉毒素含量，實驗重復3 次；用無菌打孔器打直徑6 mm 的長有黃曲霉的瓊脂塊，倒置于 PDA 培養(yǎng)基平板中央，在等距離處分別放置4 個直徑6 mm 的無菌濾紙片。取10 μL 細菌培養(yǎng)液(37 ℃營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)過夜，調整濃度為1×107個/mL)滴加到每張濾紙片上，對照加空白培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，每株細菌重復3次；液相色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18，1.8 μm，3. 0×100 mm；柱溫 40 ℃；流動相：A：甲酸水(含0.1%甲酸)，B：乙腈，梯度洗脫，流速0. 4 mL/ min，進樣量20 μL，質譜條件：電噴霧離子源，多重反應監(jiān)測，GAS Temp：350 ℃，GAS Flow：10 L/ min；Nebulizer：40 psi。

1.5.6 拮抗菌對黃曲霉毒素的分解作用：選取復篩拮抗菌菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵 24 h，取 5 mL 菌體發(fā)酵液加入4種黃曲霉毒素的混合標準品至終濃度為 20 μg / L，以空白培養(yǎng)基加入黃曲霉毒素作為空白對照，置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于 2、4、6 d 取樣，檢測 4 種黃曲霉毒素的含量，3 次重復實驗。

1.6 拮抗菌株B65-2的鑒定

1.6.1 常規(guī)鑒定方法參見文獻[7]。

1.6.2 16S rDNA PCR擴增及序列測定: B65-2基因組DNA的提取采取試劑盒的方法。以27 F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)為引物擴增細菌菌株的16S rDNA。PCR體系：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs (10 mmol) 1 μL，引物27 f (10 μmol/L-1) 1 μL，引物R1492 (10 μmol/L-1) 1 μL，模板DNA約10 pmol，Taq酶 (5 μ/μL-1) 0.25 uL，加重蒸水至50 μL。擴增條件：98 ℃ 5 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 8 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標DNA片段，由上海派諾森生物科技公司進行測序；測序結果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較，以ClustalX進行多序列比對。

2 結果與分析

2.1 花生中微生物的分離

根據菌落形態(tài)、顏色及出現早晚的差異，從表面徹底消毒的花生莢果碾碎液涂布的平板中挑取不同菌落進行純化，得到988株細菌，其中，灤南花生莢果中分離細菌菌株208株，灤縣花生莢果分離出162株，遷西花生莢果分離出182株，遷安花生莢果分離出211株，玉田和豐南獲得花生莢果225株。結果顯示，不同產區(qū)花生仔仁中的細菌數量明顯不同。

2.2 內生拮抗細菌的篩選

2.2.1 離體拮抗篩選

將花生仔仁中分離獲得的988株細菌通過對峙培養(yǎng)法進行拮抗篩選，對產毒黃曲霉拮抗效果在50%以上的10株菌進行下一步的研究(表1)。其中菌株B25-5對產毒黃曲霉的抑制率可達95.5%，其次為菌株B38-2和B22-1，抑制率分別達到83%和79.5%，拮抗效果顯著。

表1 生防菌株對黃曲霉菌的拮抗作用

2.2.2 活體拮抗篩選

將上述離體條件下具有較強拮抗作用的細菌在花生仔仁上進行抑黃曲霉毒素篩選(表2)，結果表明獲得的拮抗細菌在花生仔仁上表現出較強的抑毒效果。其中，菌株B25-5抑毒率可達92%，其次為B19-3的84.5%及B38-2的78.5%，對菌株B25-5抑黃曲霉菌毒素的效果進一步進行研究。

表2 生防菌對黃曲霉毒素的抑制效果

2.3 菌株B25-5代謝物對黃曲霉菌的影響

利用已制備的培養(yǎng)液、上清液、濾液及蛋白粗提液對黃曲菌絲生長的影響進行研究，菌株B25-5培養(yǎng)液對黃曲霉菌菌絲生長的抑制作用可達95.5%，生防菌的上清液抑菌率達到70%以上，濾液達到65%以上，蛋白粗提液的抑制作用效果較低，為57.6%。實驗結果證實，菌株B25-5及活性物質對黃曲霉菌具有較強的抑制作用，且在-4 ℃的低溫條件下具有顯著的拮抗活性(表3)。

表3 菌株B25-5及活性物質對黃曲霉菌生長的抑制作用

2.4 菌株B25-5對黃曲霉孢子萌發(fā)及黃曲霉毒素產生的抑制作用

菌株B25-5對黃曲霉菌孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，黃曲霉與拮抗菌混合培養(yǎng) 24 h 后黃曲霉孢子的萌發(fā)率顯著降低(P<0. 01)，黃曲霉孢子的萌發(fā)率由 96.5 % 下降至 4.2 %(表4)；黃曲霉與拮抗菌混合培養(yǎng)后，LC/MS/MS檢測結果發(fā)現黃曲霉毒素的產生量急劇下降，72h后4 種黃曲霉毒素未檢出(表5)。

表4 菌株B25-5對黃曲霉孢子萌發(fā)的抑制效果

表5 菌株B25-5對黃曲霉毒素的抑制效果(%)

2.5 菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解作用

利用 LC/ MS/ MS技術檢測黃曲霉毒素濃度，實驗結果證實，拮抗菌B25-5具有顯著降解黃曲霉毒素的作用，隨著時間的增加，對黃曲霉毒素的降解率逐漸升高，到第6天時，菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解率可達 92.5%。黃曲霉毒素 G1 和 G2 在菌株B25-5培養(yǎng)第 4天時未檢出，拮抗菌降解黃曲霉毒素 G1、G2 的速度顯著高于降解黃曲霉毒素 B1、B2的速度(表6)。

表6 菌株B25-5對黃曲霉毒素的降解作用/μg/mL

2.6 黃曲霉拮抗菌株B25-5的鑒定

2.6.1 常規(guī)鑒定

形態(tài)觀察發(fā)現，菌株B25-5在NA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產色素；菌體桿狀，大小為(0.9～1.2) μm×(2.8～3.2) μm；革蘭氏染色陽性；產芽孢，芽孢橢圓形；具有運動性，證明該菌株為芽孢桿菌(Bacillussp.)。

菌株生理生化測定結果見表7。菌株B25-5接觸酶反應、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纖維二糖均為陽性，氧化酶、D-阿拉伯糖等試驗均為陰性，參照文獻中細菌鑒定方法[8,9]，該菌株符合芽孢桿菌(Bacillussp.)的基本理化特性，與解淀粉芽孢桿菌有極高的相似性。

表7 菌株B25-5的生理生化特征

注：“+”為陽性反應；“-”為陰性反應。

2.6.2 16S rDNA的序列分析

以菌株B25-5基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到該菌株的16S rDNA。測序結果表明該菌株16S rDNA序列長度為1477 bp。BLAST分析發(fā)現該菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬細菌的16S rDNA相似，調出其中已鑒定菌株的16S rDNA，用Clustal W進行多重序列對比，菌株B25-5與解淀粉芽孢桿菌菌株JF496388同源性達98%。結合菌株B25-5形態(tài)特征及理化指標測定等鑒定結果，初步將菌株B25-5鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

3 討論與結論

黃曲霉毒素是已知的毒性、致癌性最強的一類天然生物毒素，被世界衛(wèi)生組織認定為Ⅰ類致癌物[10-13]。黃曲霉毒素具有穩(wěn)定的理化性質，耐高溫，難以用一般的加工處理方法去除，人或畜禽食用受黃曲霉毒素污染的農產品可導致機體病變，甚至死亡。治理農產品中黃曲霉毒素的最佳辦法就是預防[14，15]，應用微生物或其代謝產物來抑制黃曲霉毒素產生或脫毒的生物防治技術，由于對人體無害、對環(huán)境友好，成為近年來真菌毒素防治研究的熱點。利用生物技術體系來防控黃曲霉毒素污染的成功案例國外早有報道，由于種種原因，我國相關的研究起步較晚，能夠有效做為防控黃曲霉毒素污染技術手段的微生物制劑亟待開發(fā)。

本研究針對花生中黃曲霉毒素污染防控難題，采用生物防治技術，以期為我國花生黃曲霉毒素污染治理探索一條有效途徑。本研究從唐山市各種植區(qū)收獲的花生莢果中分離獲得微生物菌株988多株，其中菌株B25-5對黃曲霉生長的控制效果達90%以上，效果顯著，具有極大的開發(fā)應用潛力。在抑制黃曲霉菌生長的實驗中，拮抗菌株B25-5和黃曲霉混合培養(yǎng)24 h后，黃曲霉幾乎被完全抑制，培養(yǎng)液對黃曲霉菌菌絲生長的抑制作用可達95.5%，上清液和過濾液對黃曲霉也具有良好的控制效果，因此拮抗菌株B25-5代謝產物應該是抑制黃曲霉菌絲生長的主要機制。實驗過程中發(fā)現拮抗菌B25-5與黃曲霉孢子混合培養(yǎng)時能顯著抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，使用B25-5發(fā)酵液與黃曲霉孢子混合培養(yǎng)時，孢子萌發(fā)速度顯著小于空白對照，幾乎不產生黃曲霉毒素，證明拮抗菌發(fā)酵液能夠顯著抑制孢子萌發(fā)，且能夠降低毒素的產生。拮抗菌生長過程中產生的某些胞外抑菌活性物質，能夠顯著的干擾黃曲霉孢子的萌發(fā)，抑制黃曲霉菌絲的生長和黃曲霉毒素的產生。關于拮抗微生物對黃曲霉毒素的降解研究，國內學者孔青等報道的海洋巨大芽胞桿菌對黃曲霉毒素合成的抑制率為50.75%[16]，Abbas等[17]的研究結果顯示，他們獲得的不產黃曲霉毒素的黃曲霉菌株能夠顯著的控制產毒菌株，能夠降低 65%～94%的黃曲霉毒素產生。本研究中獲得的拮抗菌株B25-5對黃曲霉毒素B1的降解率可達 90%以上，對G1和G2可在第4天時可全部降解，證明菌株B25-5具有極強的解毒能力，應用前景廣闊。本研究表明，內生拮抗細菌B25-5可通過分泌抗菌物質，來抑制黃曲霉菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，抑制和減輕黃曲霉菌侵染和毒素污染的發(fā)生，即菌株分泌的抗菌物質為菌株抑菌抑毒機制之一。但其解毒機制、對環(huán)境中微生物種類和區(qū)系影響、對花生等農產品品質是否影響有待進一步深入探索和研究。