冠心病患者血小板CD31表達(dá)水平及超敏C反應(yīng)蛋白的測(cè)定及其意義

耿兆紅,管倩倩,李忠艷

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 大連 116027)

CD31，又稱(chēng)血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(patelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1)，是一種多功能分子，近年來(lái)對(duì)其參與炎癥反應(yīng)、血小板的聚集和血栓形成作用的研究成為熱點(diǎn)。它參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷。動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段包括從血液循環(huán)中招募炎癥細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移。這一過(guò)程主要是由細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)的，這些分子由血管內(nèi)皮和循環(huán)的白細(xì)胞介導(dǎo)，以響應(yīng)多種炎癥刺激。CD31通過(guò)參與復(fù)雜的配體間相互作用而介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附及粘附反應(yīng)，導(dǎo)致冠脈血管內(nèi)皮損傷，加重冠脈缺血及再灌注損傷。而且CD31是參與血小板黏附和聚集[1-2]的關(guān)鍵因子，在冠心病的發(fā)生與發(fā)展中有重要作用。近年來(lái)對(duì)CHD患者血漿可溶性CD31水平的研究報(bào)道較多，但關(guān)于血小板表面CD31表達(dá)水平的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。

CRP是目前研究最多的與心血管疾病相關(guān)的炎癥標(biāo)志物，是目前最有價(jià)值的急性時(shí)相蛋白。CRP被認(rèn)為是獨(dú)立于糖尿病、高血壓、高血脂等危險(xiǎn)因素之外的新的易患因素，對(duì)冠心病的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用。本研究通過(guò)檢測(cè)冠心病(coronary heart disease，CHD)患者血小板CD31表達(dá)水平及血清hs-CRP水平，探討其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年10月至2016年11月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院患者60例。其中，急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)30例，包括不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina，UA)亞組16例和急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)亞組14例；穩(wěn)定型心絞痛(stable angina,SA)5例；非冠心病(non-CHD)25例。

UA診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)靜息型心絞痛：發(fā)作于休息時(shí)，持續(xù)時(shí)間通常>20 min；(2)初發(fā)型心絞痛：通常在首發(fā)癥狀1～2月內(nèi)/很輕的體力活動(dòng)可誘發(fā)(程度至少達(dá)CCS Ⅲ級(jí))；(3)惡化型心絞痛：在相對(duì)穩(wěn)定的勞力性心絞痛基礎(chǔ)上心絞痛逐漸增強(qiáng)(疼痛更劇烈、時(shí)間更長(zhǎng)或更頻繁，按CCS分級(jí)至少增加I級(jí)水平，程度至少CCS Ⅲ級(jí))。

AMI 診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：心肌標(biāo)志物的特征性升高大于上限，并有以下至少一項(xiàng)心肌缺血的證據(jù)：(1)缺血性胸痛的表現(xiàn)；(2)指示新的心肌缺血的心電圖變化，即新的 ST 段改變或左束支傳導(dǎo)阻滯；(3)新出現(xiàn)的病理性 Q 波；(4)影像學(xué)證據(jù)示新的心肌活力丟失或新的區(qū)域性室壁運(yùn)動(dòng)異常。

Non-CHD組：心內(nèi)科住院的非冠心病患者,或不明原因及不典型心前區(qū)疼痛，心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖正常，心肌標(biāo)志物正常，冠狀動(dòng)脈CTA或冠狀動(dòng)脈造影檢查排除冠心病者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有下列情況之一者即排除在本研究之外：急、慢性病毒或細(xì)菌感染、免疫性疾病、惡性腫瘤、糖尿病、血液病、創(chuàng)傷及手術(shù)、高熱、支氣管哮喘、嚴(yán)重肝、腎功能不全、 應(yīng)用非甾體類(lèi)抗炎藥、類(lèi)固醇激素及鴉片類(lèi)藥物。

1.2 血小板表面CD31表達(dá)水平的測(cè)定

于清晨空腹采集肘靜脈血5 mL，枸櫞酸抗凝(輕輕混勻，勿大力振蕩,保證血液與抗凝液充分接觸,并立即進(jìn)行離心)，600 r/min離心20 min，加入4%多聚甲醛固定，室溫下放置10 min，加入2.5倍體積臺(tái)氏液，2000 r/min離心10 min，去上清，臺(tái)氏液懸浮沉淀，制備富含血小板懸液(4 ℃下保存)。取血小板懸液，加入適量抗體，避光孵育20 min，從暗箱中拿出，加入2 mL 臺(tái)式液，2000 r/min離心5 min，移去上清，加入2 mL 臺(tái)氏液，再次2000 r/min 離心5 min，移去上清，加入臺(tái)氏液懸浮，加等體積4%的多聚甲醛固定。4 ℃下保存,24 h內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板表面CD31的表達(dá)水平，用CELLQuest軟件獲取結(jié)果。嚴(yán)格把握時(shí)間和溫度。

1.3 血清hs-CRP測(cè)定

用免疫散射比濁法測(cè)定血清中hs-CRP含量：患者晨起空腹采集肘靜脈血2 mL，分離血清，采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Non-CHD組、SA組、ACS,UA亞組、AMI亞組基本臨床特征比較

各組間，各亞組間患者性別、年齡、收縮壓、舒張壓、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDLC)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、吸煙等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

表1 Non-CHD組、SA組、ACS,UA亞組、AMI亞組基本臨床特征比較Tab 1 Comparison of basic clinical features between non-CHD group,SA group,ACS group and UA subgroup,AMI subgroup

2.2 ACS組、SA組、non-CHD組CD31的表達(dá)水平

ACS組、SA組、non-CHD組的CD31表達(dá)水平分別為(95.24±6.29)%、(57.38±10.27)%、(54.83±8.73)%，ACS組明顯高于SA組及non-CHD組，差異有非常顯著性(P<0.01)，在SA組與非冠心病組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)圖1。ACS組中的UA亞組和AMI亞組CD31表達(dá)水平分別為(94.10±6.90)%、(96.54±5.47)%，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

#兩組間比較，P<0.01圖1 ACS組、SA組與non-CHD組CD31表達(dá)水平比較Fig 1 Comparison of expression levels of platelet CD31 among ACS group,SA group and non-CHD group

* UA亞組與AMI亞組CD31比較，P>0.05圖2 UA亞組AMI亞組血小板CD31表達(dá)水平比較Fig 2 Comparison of expression levels of platelet CD31 between UA subgroup and AMI subgroup

2.3 ACS組、SA組、non-CHD組hs-CRP的表達(dá)水平

ACS組、SA組、non-CHD組的hs-CRP水平分別為(6.15±2.62 )mg/L、(0.93±0.51)mg/L、(0.76±0.52)mg/L。ACS組亦明顯高于SA組及non-CHD組，差異有非常顯著性(P<0.01)，在SA組與non-CHD組之間差異也無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)圖3。ACS組中的UA亞組和AMI亞組hs-CRP水平分別為(5.69±2.32) mg/L、(6.68±2.92)mg/L，差異亦無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

#兩組間比較，P<0.01圖3 ACS組、SA組與non-CHD組hs-CRP水平比較Fig 3 Comparison of hs-CRP levels among ACS group,SA group and non-CHD group)

* UA亞組與AMI亞組hs-CRP比較，P>0.05圖4 UA亞組AMI亞組hs-CRP水平比較Fig 4 Comparison of hs-CRP levels between UA subgroup and AMI subgroup

2.4 CHD患者血小板CD31表達(dá)水平、血清hs-CRP水平相關(guān)性分析

CHD患者血小板CD31、血清hs-CRP的相關(guān)性分析:血小板CD31、血清hs-CRP因素二者呈明顯的正相關(guān)(r=0.681,P<0.01)，直線回歸方程Y=71.666+3.359X，Y代表CD31；X代表hs-CRP，見(jiàn)圖5。

圖5 CHD患者血小板CD31表達(dá)水平、血清hs-CRP水平線性回歸分析Fig 5 Linear regression analysis of platelet CD31 expression level and serum hs-CRP level in CHD patients

3 討 論

CHD病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展,目前研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是一種動(dòng)脈血管損傷的慢性炎癥過(guò)程，AS病變的形成是從以單核細(xì)胞為主的多種白細(xì)胞在動(dòng)脈血管壁上浸潤(rùn)[5]開(kāi)始，通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間隙移入內(nèi)膜并聚集，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷，是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。這一過(guò)程由多種細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子以及趨化因子介導(dǎo)[6]。CD31在白細(xì)胞遷移穿越內(nèi)皮細(xì)胞間連接和血管外基底膜的過(guò)程中有重要作用。有研究表明特異性抗CD31抗體、CD31阻斷劑均可抑制白細(xì)胞的遷移，抑制白細(xì)胞的浸潤(rùn)和白細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷[7-8]。本研究結(jié)果顯示，ACS患者血小板CD31的表達(dá)水平明顯高于SA組和non-CHD組(P<0.01)，提示非冠心病患者或SA患者，在發(fā)展成ACS時(shí)血小板CD31激活并顯著表達(dá)于血小板表面。ACS的主要發(fā)生機(jī)制為冠狀動(dòng)脈血管壁粥樣斑塊破裂，血小板活化，繼發(fā)血小板聚集和血栓形成，引起冠狀動(dòng)脈急性完全或不完全堵塞。活化血小板表達(dá)的膜糖蛋白種類(lèi)很多，如血小板顆粒膜糖蛋白GMP-140 (P-選擇素、CD62P)及溶酶體膜蛋白LIMP(CD63)，血小板膜糖蛋白GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、以及GPⅠa/Ⅱa、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ復(fù)合物等?；罨难“遄鳛橐环N炎性細(xì)胞，其表達(dá)的粘附分子不僅在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，在血栓形成的過(guò)程中也具有重要作用，而且也直接參與了缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在正常情況下，血液循環(huán)中的血小板處于靜止?fàn)顟B(tài)。CD31 在靜止血小板表面也有表達(dá)，平均每個(gè)血小板表達(dá)約8000個(gè)CD31分子。當(dāng)凝血酶、組胺、氧自由基、血液流動(dòng)的高剪切力等因素刺激血小板活化時(shí)，血小板顆粒膜與質(zhì)膜或表面連接小管系統(tǒng)膜融合，顆粒膜、溶酶體膜及血小板膜的糖蛋白在血小板膜表面表達(dá)大量增加。CD31在活化形成血栓的血小板表面有兩倍的表達(dá)[9]。故推測(cè)，監(jiān)測(cè)CHD患者血小板CD31表達(dá)水平，可能對(duì)ACS的診斷提供一定的參考價(jià)值。另外，在ACS組內(nèi)，UA患者與AMI患者比較，血小板CD31表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，考慮可能與UA、AMI二者共同發(fā)病機(jī)制有關(guān)，均由炎癥、免疫反應(yīng)引起粥樣斑塊不穩(wěn)定，進(jìn)而血小板活化、聚集導(dǎo)致的一系列臨床事件。

ACS組患者h(yuǎn)s-CRP水平明顯高于SA組和non-CHD組，這表明ACS患者較SA患者存在明顯的炎癥反應(yīng)。雖然SA患者冠脈斑塊內(nèi)也存在炎癥反應(yīng)，但hs-CRP水平在SA組和non-CHD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明SA患者炎癥反應(yīng)程度較輕，因此其血清中的hs-CRP水平并不高于non-CHD組。故hs-CRP水平在心臟有急性炎癥反應(yīng)和損傷時(shí)升高明顯，在粥樣斑塊性質(zhì)較穩(wěn)定時(shí)無(wú)明顯變化，表明hs-CRP水平的增高與冠脈炎癥反應(yīng)程度和組織損傷密切相關(guān)，可反映粥樣斑斑塊的穩(wěn)定性。還有一些研究表明,血清hs-CRP 水平增高是未來(lái)心血管事件的一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[10]。

本研究中，CHD患者血小板CD31的表達(dá)水平與血清hs-CRP水平通過(guò)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血小板CD31的表達(dá)水平與血清hs-CRP水平呈明顯正相關(guān)(r=0.487,P<0.01)，說(shuō)明二者都參與了冠脈粥樣斑塊的形成,對(duì)于AS發(fā)生發(fā)展及血栓形成過(guò)程起相互促進(jìn)作用。目前，血清hs-CRP被視為反映粥樣斑塊不穩(wěn)定性的重要炎癥標(biāo)志物之一，本研究顯示CHD患者血小板CD31與其正相關(guān)。機(jī)制可能與內(nèi)皮微顆粒(endothelial microparticles，EMPs)有關(guān)，內(nèi)皮微顆粒是內(nèi)皮細(xì)胞在激活或凋亡脫落下來(lái)的小囊泡，是炎癥和血栓形成的生物影響因素[11-12]。hs-CRP 刺激可通過(guò)抑制 BH4，從而導(dǎo)致eNOs 脫偶聯(lián)，導(dǎo)致EMP的生成，已有研究證明[13],CD31 參與血小板的粘附和聚集反應(yīng)，并介導(dǎo)血栓形成過(guò)程中血小板之間、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞之間的信息傳遞。目前較廣泛用于識(shí)別 EMPs 的特異性抗體是CD31。但更具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和探討。