潘 城, 吳 凌, 謝 勇, 許文琪, 白 洋, 黃永輝, 胡朝陽(yáng)

(福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院, 福建 福州 350002)

著色劑可賦予化妝品美麗的顏色,對(duì)化妝品起到美化、修飾的作用,因此廣泛應(yīng)用于化妝品特別是彩妝產(chǎn)品。但是化妝品中使用的著色劑多數(shù)是合成工業(yè)染料,可引起眼睛、口腔、皮膚等部位發(fā)炎,影響人體內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng),甚至誘發(fā)癌癥,長(zhǎng)期或過量使用會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[1]。直接染料是工業(yè)合成染料中一大類活性較強(qiáng)的染料,由于大多數(shù)為偶氮類結(jié)構(gòu),具有致癌、致突變作用,直接染料品種被禁用數(shù)量居各染料品種之首[2,3]。近年來(lái),世界范圍內(nèi)均致力于開發(fā)利用各種天然或功能性材料用以吸附降解環(huán)境中的直接染料,降低其對(duì)環(huán)境和人體的風(fēng)險(xiǎn)[4-15]。歐盟和我國(guó)也相繼出臺(tái)了化妝品中直接染料的禁限用規(guī)定。歐盟化妝品法規(guī)[16]禁用組分列表中涉及的直接染料有直接黃12、直接紅81、直接紅80、直接紅23、直接黑51、直接紅28、直接黑38、直接棕95、直接藍(lán)6和直接紫48;限用表中涉及的有直接橙39,其專用于僅和皮膚暫時(shí)接觸的化妝品。我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[17]禁用列表中涉及的直接染料有直接黃12、直接紅81、直接紅80、直接紅23、直接黑51、直接紅28、直接黑38、直接棕95、直接藍(lán)6和直接紫48,限用表中涉及的有直接橙39,其專用于僅和皮膚暫時(shí)接觸的化妝品。

目前對(duì)直接染料的檢測(cè)方法大多采用分光光度法[18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-28]和高效液相色譜法[29-35]。分光光度法靈敏度較差,無(wú)法同時(shí)對(duì)多種直接染料進(jìn)行定量分析;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本高,難以普及應(yīng)用;高效液相色譜法已應(yīng)用于工業(yè)合成染料的檢測(cè)中,具有檢測(cè)成本低、適合高通量分析、定量準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前,直接染料主要研究對(duì)象集中在食品、紡織品、水體、藥材等方面,且只針對(duì)一種或幾種直接染料進(jìn)行分析,無(wú)法滿足現(xiàn)代分析高通量篩查的需求,化妝品中多種禁限用直接染料的高通量分析檢測(cè)方法還未見報(bào)道。

本文針對(duì)化妝品中12種直接染料,采用C18柱進(jìn)行梯度洗脫分離,以乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)為流動(dòng)相,經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè),建立了高效、準(zhǔn)確、快速、靈敏的化妝品中多種直接染料同時(shí)分離檢測(cè)的技術(shù),為化妝品中直接染料的檢測(cè)和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司); Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);渦旋混合器(江蘇健康醫(yī)藥公司); Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司);分析天平(0.1 mg,賽多力科(北京)科學(xué)有限公司)。

乙酸銨(優(yōu)級(jí)純,上海生工生物工程有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司);三氯甲烷、無(wú)水乙醇、正己烷(優(yōu)級(jí)純,上海生工生物工程有限公司)。直接染料標(biāo)準(zhǔn)品:直接紅28(純度98%, CAS No. 573-58-0)購(gòu)自德國(guó)CNW科技公司;直接棕95(純度100%, CAS No. 16071-86-6)和直接藍(lán)6(純度100%, CAS No. 2602-46-2)購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;直接黑38(純度98%, CAS No. 1937-37-7)購(gòu)自百靈威科技有限公司;直接黃12(純度100%, CAS No. 2870-32-8)、直接紅80(純度100%, CAS No. 2610-10-8)、直接藍(lán)1(純度100%, CAS No. 2610-05-1)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;直接紅81(純度98%, CAS No. 2610-11-9)購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;直接紅23(純度99%, CAS No. 3441-14-3)購(gòu)自上海一研生物科技有限公司;直接橙39(純度100%, CAS No. 1325-54-8)購(gòu)自上海將來(lái)生化試劑有限公司;直接黑51(純度95%, CAS No. 3442-21-5)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;直接紫48(純度98%, CAS No. 37279-54-2)購(gòu)自日本純和藥業(yè)公司。0.20 μm聚四氟乙烯(PTFE)膜購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,0.45 μm聚醚砜水相膜和尼龍膜購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量各染料標(biāo)準(zhǔn)品,置于100 mL容量瓶中,用0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)溶解并定容至刻度,配制成質(zhì)量濃度為490～4 077 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;用0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制質(zhì)量濃度為0.2～408 mg/L的8個(gè)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1膏狀、粉狀等固體樣品和指甲油樣品

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL螺紋蓋離心管中(膏狀樣品用玻璃棒均勻涂抹在離心管底部),加入25 mL三氯甲烷,渦旋溶解分散樣品,隨后加入0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)10 mL,液液萃取5 min,以10 000 r/min離心5 min后,取上層水相溶液,過0.20 μm PTFE濾膜,濾液供液相色譜測(cè)定。

1.3.2水狀液體樣品

稱取試樣1.0 g(精確至0.000 1 g),置于25 mL具塞比色管中,用0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)稀釋定容至10 mL,混勻,過0.20 μm PTFE濾膜,濾液供液相色譜測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱:XB-C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm,美國(guó)Welch公司);柱溫:35 ℃;流速:1. 0 mL/min;流動(dòng)相:(A)乙腈和(B)0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)。洗脫梯度程序:0～3.0 min, 3%A; 3.0～15.0 min, 3%A～30%A; 15.0～30.0 min, 30%A～38%A; 30.0～35.0 min, 38%A～60%A; 35.0～35.1 min, 60%A～3%A; 35.1～40.0 min, 3%A。進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器:光電二極管陣列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):404 nm(直接黃12)、508 nm(直接紅80、直接紫48、直接紅81、直接紅23、直接紅28、直接橙39和直接棕95)和625 nm(直接藍(lán)6、直接藍(lán)1、直接黑51和直接黑38)。

圖 1 采用不同色譜柱時(shí)12種直接染料的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 12 direct dyes using different chromatographic columns 1. direct red 80; 2. direct blue 6; 3. direct blue 1; 4. direct violet 48; 5. direct red 81; 6. direct red 23; 7. direct red 28; 8. direct orange 39; 9. direct brown 95; 10. direct black 51; 11. direct yellow 12; 12. direct black 38.

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為了考察檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)目標(biāo)化合物檢測(cè)靈敏度的影響,二極管陣列檢測(cè)器在190～800 nm范圍內(nèi)對(duì)12種直接染料進(jìn)行光譜掃描。12種直接染料分別在404 nm(直接黃12)、508 nm(直接紅80、直接紫48、直接紅81、直接紅23、直接紅28、直接橙39、直接棕95)和625 nm(直接藍(lán)6、直接藍(lán)1、直接黑51、直接黑38)處有較大吸收。因此,本實(shí)驗(yàn)采用多波長(zhǎng)檢測(cè),檢測(cè)波長(zhǎng)分別為404、508和625 nm。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)比較了Symmetry-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和Ultimate XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱對(duì)12種直接染料的分離效果。直接紅81和直接紅23在Symmetry-C18色譜柱上無(wú)法分離;各目標(biāo)物在Ultimate XB-C18色譜柱上均能實(shí)現(xiàn)良好分離,且靈敏度更高,峰形更尖銳。因此本實(shí)驗(yàn)選用Ultimate XB-C18色譜柱作為分離色譜柱。

圖 2 采用不同流動(dòng)相時(shí)12種直接染料的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 12 direct dyes using different mobile phases a. acetonitrile-water; b. methanol-0.02 mol/L ammonium acetate solution (pH 9.0); c. acetonitrile-0.02 mol/L ammonium acetate solution (pH 9.0). Peak Nos. 1-12 were the same as in Fig. 1.

2.2.2流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-純水、甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液和乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)3種流動(dòng)相體系的分離效果,結(jié)果見圖2。采用乙腈-純水時(shí),12種直接染料的峰形和分離度均不理想;采用甲醇-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)時(shí)12種直接染料出峰較慢,且分離度不理想;采用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨水溶液(pH 9.0)時(shí)12種直接染料均有良好的峰形和分離效果。因此本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液(pH 9.0)作為流動(dòng)相。

2.2.3流動(dòng)相pH值的選擇

考察了不同pH值(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.0和9.5)的0.02 mol/L乙酸銨水溶液對(duì)12種直接染料分離效果的影響,結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,當(dāng)pH值低于9.0時(shí),直接紅80和直接黑51峰形和靈敏度較差,甚至有不出峰情況,直接棕95峰形脫尾嚴(yán)重;當(dāng)pH值增加至9.0,所有目標(biāo)物峰形均得到明顯改善,同時(shí)靈敏度提高,再繼續(xù)增加pH值,各目標(biāo)物分離效果和靈敏度無(wú)明顯變化。由于XB-C18色譜柱最佳pH范圍為1.0～10.0,故選擇pH值9.0的0.02 mol/L乙酸銨水溶液-乙腈體系作為流動(dòng)相。

圖 3 采用不同pH值的流動(dòng)相時(shí)12種直接染料的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the 12 direct dyes using different pH values of mobile phasesPeak Nos. 1-12 were the same as in Fig. 1.

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1樣品溶解液的選擇

考察了甲醇、乙腈、正己烷、乙醇、三氯甲烷、四氫呋喃等對(duì)1.0 g口紅、粉餅和指甲油等樣品的分散溶解情況。結(jié)果表明,甲醇、乙醇、乙腈、正己烷均無(wú)法溶解樣品,四氫呋喃能溶解膏狀樣品,但其溶解后與水相提取溶液互溶,帶入更多干擾物質(zhì),且易堵塞色譜柱,導(dǎo)致色譜柱損壞過快。三氯甲烷對(duì)膏狀化妝品等固體樣品具有良好的溶解分散作用,但是一定量的三氯甲烷試劑僅能溶解對(duì)應(yīng)量的樣品。因此考察了不同用量(5、10、15、20、25、30和35 mL)的三氯甲烷對(duì)1.0 g樣品的分散溶解情況。結(jié)果表明,三氯甲烷用量為25 mL時(shí)即可使樣品完全分散溶解。因此選擇加入25 mL三氯甲烷。

2.3.2不同提取試劑的選擇

考察了10 mL甲醇、乙酸銨(pH 9.0)和純水對(duì)加標(biāo)口紅、粉餅樣品中12種直接染料的萃取效率。結(jié)果顯示,采用10 mL乙酸銨(pH 9.0)時(shí)提取效率最佳,回收率為90.6%～102.4%;純水的提取效率較低,回收率為12.6%～110.0%;甲醇與三氯甲烷發(fā)生互溶,使得液液萃取操作無(wú)法進(jìn)行。因此本實(shí)驗(yàn)選擇10 mL乙酸銨(pH 9.0)進(jìn)行液液萃取。

2.3.3吸附濾膜的選擇

考察了不同材質(zhì)濾膜對(duì)樣品溶液中12種直接染料的吸附性情況。結(jié)果表明,PTFE膜對(duì)12種直接染料吸附性效果均較差,吸附率在5%以下;聚醚砜水相膜對(duì)直接紅28、直接黑38、直接黑51等吸附性效果較好,吸附率均大于30%;尼龍膜表現(xiàn)出極強(qiáng)的吸附性能,對(duì)絕大多數(shù)直接染料吸附率為100%,因而選擇PTFE膜進(jìn)行樣品過濾操作。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各分析物的峰面積(Y)和相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程。結(jié)果表明,各目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)12種染料的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.999(見表1)。以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限和定量限。結(jié)果表明,12種直接染料的檢出限范圍為0.017～1.7 μg/g,定量限范圍為0.058～5.6 μg/g。

表 1 12種直接染料的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.5 回收率和精密度

以空白基質(zhì)樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平平行測(cè)定6次。結(jié)果表明,12種直接染料的平均加標(biāo)回收率為85.6%～113.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～7.7%(見表2)。說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,可用于化妝品中直接染料的日常分析檢測(cè)。

2.6 穩(wěn)定性

取高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的直接染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于室溫下放置2、4、6、8、12 h和1～6 d,考察直接染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性。結(jié)果表明,高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的直接染料的日內(nèi)精密度分別為0.4%～2.4%、0.6%～4.8%和0.5%～6.5%;日間精密度分別為0.2%～3.7%、1.9%～6.7%和1.7%～7.5%。由此可見,12種直接染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性較好。

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法分別對(duì)水劑類、粉類、棒狀類等市售的不同類型、不同批次的化妝品樣品共計(jì)25件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均未檢測(cè)出直接染料化合物。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜同時(shí)分離檢測(cè)化妝品中12種直接染料的方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和通量高等特點(diǎn),可滿足化妝品企業(yè)、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫部門、化妝品質(zhì)量監(jiān)督部門對(duì)不同類型化妝品中直接染料的檢測(cè)要求,為我國(guó)化妝品質(zhì)量管理監(jiān)控提供必要的技術(shù)支持和方法依據(jù)。