張佩敏,鐘其頂*,王道兵,岳紅衛(wèi),李國輝

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100015) 2(全國食品發(fā)酵標準化中心,北京,100015)

隨著人民生活水平不斷提高，健康、純天然的高品質(zhì)食品逐漸受到消費者青睞。然而，受經(jīng)濟利益的驅(qū)使，一些不法商家為降低成本，采用摻假摻雜、混亂標注等手段制造假冒偽劣食品，如葡萄汁中外源添加廉價糖，用“三精一水”配制“葡萄酒”等[1]。因此，對食品進行真實性檢驗已成為現(xiàn)代食品檢測研究的重要內(nèi)容[2]，但傳統(tǒng)的理化、感官分析等方法難以解決上述廉價原料和混亂標注問題。穩(wěn)定同位素技術(shù)探究食品(或其特征組分)的原子水平信息，可鑒別不同來源的同種化合物，因此在食品摻假檢測中發(fā)揮著重要作用[3]，在蜂蜜[4]、果汁[5]、葡萄酒[5]等食品的真?zhèn)舞b別中發(fā)揮著重要作用，其中一些方法已被歐洲標準委員會(Comité Européen de Normalisation，CEN)、美國分析化學家協(xié)會(Association of Official Analytical Chemists，AOAC)采納為標準方法。

分餾是同位素的自然屬性[2]，同類食品/化合物的同位素特征也會在一定范圍內(nèi)波動，因此當前同位素技術(shù)的應(yīng)用以同位素數(shù)據(jù)庫的建設(shè)為前提，如CEN建立了歐洲葡萄酒同位素數(shù)據(jù)銀行，國際果蔬汁行業(yè)協(xié)會(Sure-Global-Fair，SGF)建立了全球果汁同位素數(shù)據(jù)庫，但數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建與維護成本高昂，也難以涵蓋所有樣品。利用同位素內(nèi)源標志物建立食品的穩(wěn)定同位素指紋圖譜是近年來的研究熱點[2]。內(nèi)源標志物(以下簡稱內(nèi)標物)是指與目標物來源相同或相關(guān)，且同位素組成具穩(wěn)定、良好的相關(guān)性的一類物質(zhì)[6-7]。如蜂蜜和果汁造假時普遍摻入廉價糖漿，但蜂蜜的總糖與蛋白質(zhì)δ13CVPDB值密切相關(guān)[8]，果汁的總糖與果肉δ13CVPDB值相近[9]。近年來，CABANERO[10]和ELFLEIN[11]等人分別研究了蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖的碳同位素特征，互相作為內(nèi)標物以提高蜂蜜真?zhèn)舞b別能力；GUYON曾分析了20個法國葡萄酒樣品的甘油和乙醇的δ13CVPDB特征，但由于甘油在葡萄酒感官體驗中的重要作用而易被摻假，因此限制了甘油作為內(nèi)標物的應(yīng)用[14]。

酒石酸(tartaric acid)是葡萄汁和葡萄酒中的主要有機酸和特征酸[13]。雖然GB2760中允許酒石酸作為食品添加劑加入葡萄酒，但如果葡萄汁的糖酸比平衡，就不存在外源添加酒石酸的情況。當前一些廠家打出了“完全無添加”葡萄酒的旗號，打造高端葡萄酒產(chǎn)品[14]，針對此類葡萄酒中是否含有外源酒精的檢測問題，可以嘗試以酒石酸進行碳同位素內(nèi)標物的應(yīng)用研究。

本課題研究了葡萄汁和葡萄酒中總糖、乙醇和酒石酸的同位素分布特征，分析發(fā)酵過程對酒石酸碳同位素組成的影響，并探討酒石酸作為葡萄汁中總糖的碳同位素內(nèi)標物、作為葡萄酒中乙醇的碳同位素內(nèi)標物在摻假檢測中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氦氣、二氧化碳氣體(純度99.99%),北京北溫氣體制造廠;丙酮(色譜純)，DUKSAN Pure Chemicals；Ca(OH)2、NaOH和HCl(分析純)，北京化學試劑廠；乙醇RM(色譜純，國產(chǎn)，室標reference material δ13CVPDB=-10.98‰)；IAEA-CH-6[國際原子能機構(gòu)，δ13CVPDB=(-10.45±0.2)‰]；IAEA-601[國際原子能機構(gòu)，δ13CVPDB=(-27.77±0.04)‰]；錫杯,Element Microanalysis公司產(chǎn)品。

從4個莊園收集16個葡萄酒樣品，其中8個完全無添加，8個添加外源乙醇。2個標識為有機葡萄酒(完全無添加)，購于某超市。2016年8～10月，采集4個不同產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄，每個產(chǎn)區(qū)取樣2份，共計8份釀酒葡萄。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-燃燒-穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)：Delta V Advantage 穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)，配備Ultra Trace GC氣相色譜與IsoLink接口，以及Triplus自動進樣器；HP-INNOwax氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫科技(中國)有限公司)；元素分析儀(EA)：與GC-C-IRMS共用穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀，配備Flash 2000元素分析儀；HPLC：Waters 2695 高效液相色譜儀；配備waters 2998 紫外檢測器(安捷倫科技(中國)有限公司)；LiChrospher 100RP18色譜柱(5 μm×500 mm×30 mm，德國Merk公司)；陽離子交換柱(10 g，Ag50W-X8，200-400 mesh)，陰離子交換柱(10 g，Ag1-X8，200-400 mesh，北京泰澤瑞達科技有限公司)；離心機(美國Sigma公司)；冷凍干燥機(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)；電熱恒溫水浴箱(北京中慧天誠科技有限公司)；十萬分之一電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 乙醇的前處理方法[15]

根據(jù)測定線性范圍(2～10 V)及色譜條件，用丙酮將樣品稀釋至乙醇含量約8 g/L。

1.3.1.2 總糖提取方法[9]

選取健康無破損葡萄榨汁后過濾，取40 mL濾液，加入1.6 g Ca(OH)2粉末，混合均勻并于90 ℃水浴3 min后將上述熱溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，1 400×g離心3 min，去除沉淀，用0.1 mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)上清液至pH為5.0；將酸化后的上清液置于4 ℃冰箱靜置約15 h，再次離心去除沉淀，將溶液冷凍干燥，并均質(zhì)成粉末后待測。

1.3.1.3 酒石酸的分離方法[16]

應(yīng)用5 mol/L的HCl溶液活化陽離子交換柱(10 g，Ag50W-X8，200-400 mesh)后，將葡萄酒或發(fā)酵液離心取上清液50 mL，用5 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)至pH為1.7后上樣，用100 mL的25 mmol/L HCl溶液洗脫，氨基酸等陽離子保留于柱體內(nèi)，收集完整的洗脫液并用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 7.0，在陽離子交換柱(10 g，Ag1-X8，200-400 mesh)(活化條件同上)上樣,用200 mL超純水淋洗，做快速測試(顏色反應(yīng))，確保所有糖均被洗脫。將完全洗脫的糖，應(yīng)用100 mL 1 mol/L HCl溶液洗脫，將該洗脫液在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2.5 mL左右，過0.22 μm濾膜，根據(jù)檢測信號在線收集整個酒石酸峰的餾出液，備用。

1.3.1.4 葡萄汁發(fā)酵

葡萄榨汁取200 mL，加入0.04 g偏重亞硫酸鉀(防止發(fā)酵過程雜菌干擾)，加入1 g活性干酵母在30 ℃條件下恒溫厭氧發(fā)酵至恒重，每種樣品重復(fù)發(fā)酵2次。

1.3.2 儀器條件

1.3.2.1 GC條件[15]

載氣為氦氣，柱流速1.2 mL/min；進樣口溫度240～270 ℃；升溫程序為：起始溫度40 ℃，保持5 min，以1 ℃/min 升溫至50 ℃后保持1 min，再以15 ℃/min 升溫至250 ℃并保持2 min；進樣體積1 μL；分流比10∶1。

1.3.2.2 乙醇轉(zhuǎn)化條件

燃燒轉(zhuǎn)化裝置(IsoLink)中配備陶瓷(Al2O3)氧化管(填料為CuO，NiO和Pt)，工作溫度為1 000 ℃。

1.3.2.3 EA條件[9]

氧化管溫度980 ℃，還原管溫度680 ℃，柱溫60 ℃，氦氣流速100 mL/min，氧氣充入時長為3 s(流速250 mL/min)；稱取0.1 mg有機物于錫杯中，包樣后測定。

1.3.2.4 HPLC制備條件[16]

流動相20 mmol/L H3PO4；柱溫30 ℃；流速3 mL/min。

1.3.2.5 IRMS條件

離子源電壓2.97 kV，真空度1.8×10-6mbar，轟擊電壓120.8 eV。

1.4 校準與計算

基于國際基準物質(zhì)V-PDB(Vienna Pee Dee Belemnite Standard，13C/12C=0.011 237 2)得出樣品中組分δ13CVPDB值(‰)：δ13CVPDB=(13C/12C)樣品值/(13C/12C)參考值。IAEA-CH-6(δ13CVPDB)作為實際測定中的參考物質(zhì)。

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄汁中酒石酸與總糖碳同位素特征

收集不同產(chǎn)地的釀酒葡萄樣品，按照1.3方法測定葡萄汁總糖和酒石酸的δ13CVPDB值，每個樣品測定2次，結(jié)果見表1。

表1 葡萄汁總糖、酒石酸δ13CVPDB值比較Table 1 Comparison δ13CVPDB values of sugar content and tartaric acid in musts

表1數(shù)據(jù)表明，4個產(chǎn)地的樣品具有不同的同位素特征，總糖和酒石酸δ13CVPDB的分布范圍分別為-28.13‰～-23.25‰和-24.48‰～-20.02‰，這是由于釀酒葡萄取自我國4個不同產(chǎn)區(qū)，各產(chǎn)區(qū)氣候條件相差較大，影響了同位素的分餾。對比酒石酸和總糖，酒石酸δ13CVPDB明顯比總糖偏正，這是因為葡萄生長過程中以葡萄糖(C6H12O6)為底物在相關(guān)酶的作用下產(chǎn)生酒石酸(C4H6O6)，該過程有碳原子損失。根據(jù)Rossmann的研究結(jié)果[17]，葡萄糖上6個碳位點上的13C/12C比值為非統(tǒng)計學分布，相對于葡萄糖分子的δ13CVPDB值，C3偏正1.9‰，C4偏正6.3‰，而C1偏負1.3‰，C2偏負0.9‰，C5偏負1.1‰，C6偏負4.5‰；葡萄糖代謝產(chǎn)生含有6個碳的L-抗壞血酸，6個碳原子均來源于葡萄糖，因此同位素豐度不變，L-抗壞血酸經(jīng)五步代謝過程得到L-酒石酸，中間物質(zhì)依次為2-酮-L-葡萄糖酸、L-艾杜糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸、L-threo-tetruronate[5]，最后通過C4～C5裂解途徑產(chǎn)生酒石酸與乙醇酸[18]，5號碳與6號碳的損失導(dǎo)致酒石酸相對葡萄糖δ13CVPDB偏正。但是二者差異并非固定值，這可能與葡萄生長環(huán)境導(dǎo)致葡萄糖6個碳位點上13C/12C比值不同有關(guān)。

圖1 葡萄汁中總糖和酒石酸δ13CVPDB值之間的相關(guān)性Fig.1 Correlation of δ13CVPDB values between sugar content and tartaric acid in musts

以總糖δ13CVPDB值為橫坐標，酒石酸δ13CVPDB值為縱坐標，繪制其相關(guān)性曲線，圖1表明總糖與酒石酸碳同位素值存有差異，但二者具有良好相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)R2=0.944 9)。選擇A產(chǎn)區(qū)的葡萄汁樣品，以C4糖和蒸餾水為基礎(chǔ)配制與葡萄汁濃度相同的糖水溶液，按等比例向葡萄汁樣品中加入上述糖水溶液，混合均勻后測定總糖與酒石酸δ13CVPDB值，可以看出總糖δ13CVPDB呈現(xiàn)逐步偏正的趨勢，但酒石酸δ13CVPDB值并未出現(xiàn)變化(見圖2)，說明酒石酸可以作為總糖的碳同位素內(nèi)標物對葡萄汁進行摻糖檢測。

圖2 添加不同比例的C4糖后葡萄汁中總糖與酒石酸δ13CVPDB變化Fig.2 Change curve of the δ13CVPDB value of sugar content and tartaric acid with different ratio of C4 sugar

2.2 酒精發(fā)酵對葡萄汁中酒石酸δ13CVPDB影響

為探究酒精發(fā)酵對葡萄汁中酒石酸δ13CVPDB影響，按照1.3中方法發(fā)酵4個產(chǎn)區(qū)的葡萄汁，每個產(chǎn)區(qū)選取1個樣品，每個樣品發(fā)酵2份并重復(fù)測定3次，結(jié)果見表2。

表2 酒精發(fā)酵前后酒石酸δ13CVPDB值的變化Table 2 Change of δ13CVPDB values of tartaric acid during fermentation

由表2可知，盡管4個莊園葡萄汁/葡萄酒的酒石酸δ13CVPDB值不同，但葡萄汁發(fā)酵前后酒石酸的δ13CVPDB值基本不變(|Δ13CVPDB|<0.1‰)，這說明發(fā)酵過程中不會改變葡萄汁中酒石酸的碳同位素組成特征。

2.3 酒石酸與乙醇碳同位素特征相關(guān)性分析

按照1.3與1.4前處理步驟，測定發(fā)酵液中乙醇δ13CVPDB，對比酒石酸與乙醇結(jié)果見表3。

由表3數(shù)據(jù)可知，發(fā)酵前葡萄汁總糖δ13CVPDB值分布范圍為-28.65‰～-22.91‰，發(fā)酵后乙醇δ13CVPDB值分布范圍為-29.93‰～-24.23‰，發(fā)酵糖δ13CVPDB與對應(yīng)發(fā)酵液中乙醇δ13CVPDB也不完全一致，差異分布范圍為-2.03‰～-1.10‰，乙醇比原料葡萄汁總糖的δ13CVPDB值更偏負。盡管如此，乙醇與總糖之間具有明顯的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)可達0.98，既然在葡萄汁中，酒石酸可作為總糖的內(nèi)標物，且2.2的研究表明發(fā)酵過程不影響酒石酸δ13CVPDB值，則酒石酸與乙醇之間必然存在良好相關(guān)性。為探究葡萄酒中酒石酸與乙醇的關(guān)系，以酒石酸δ13CVPDB值為橫坐標，乙醇δ13CVPDB值為縱坐標，繪制相關(guān)性曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在發(fā)酵液中，乙醇與酒石酸具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)可達0.96。

表3 葡萄汁總糖、發(fā)酵液中乙醇與酒石酸δ13CVPDB值的比較Table 3 Comparison δ13CVPDB values of sugar content in musts and ethanol， tartaric acid in fermentation liquor

圖3 發(fā)酵液中乙醇和酒石酸δ13CVPDB值之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation of δ13CVPDB values between ethanol and tartaric acid in fermentation liquor

以玉米酒精和蒸餾水為基礎(chǔ)配制與葡萄酒濃度相同的乙醇水溶液，按等比例向葡萄酒樣品中加入上述乙醇水溶液，混合均勻后測定乙醇與酒石酸δ13CVPDB值，結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯鲆掖鸡?3CVPDB呈現(xiàn)逐步偏正的趨勢，但酒石酸δ13CVPDB值并未出現(xiàn)變化，說明酒石酸可以作為乙醇的碳同位素內(nèi)標物對葡萄酒進行摻乙醇檢測。

圖4 添加不同比例的玉米酒精后葡萄酒中乙醇與酒石酸δ13CVPDB變化Fig.4 Change curve of the δ13CVPDB value of ethanol and tartaric acid with different ratio of exogenous ethanol addition

針對內(nèi)標物在食品摻假檢測中的應(yīng)用，JAMIN等人應(yīng)用差值法建立了蘋果酸作為糖類內(nèi)標物的簡單模型[16]，同時應(yīng)用比值法建立了橙汁中水和乙醇的數(shù)學模型[12]，該模型可對橙汁進行鑒別分析。本研究在借鑒JAMIN差值與比值模型的基礎(chǔ)上分析了發(fā)酵液中乙醇δ13CVPDB與酒石酸δ13CVPDB的差值與比值，乙醇與酒石酸的δ13CVPDB差值范圍在-5.20‰±0.39‰之間，比值范圍在1.23±0.02之間，差值模型的標準偏差為0.56，比值模型的標準偏差僅為0.02。基于此，建立了差值模型與比值模型用于檢測葡萄酒中是否有外源乙醇的添加。

2.4 葡萄酒樣品分析

16個葡萄酒樣品，其中8個完全無添加，8個添加了外源乙醇。測定樣品中酒石酸與乙醇δ13CVPDB(n=3)，并分別計算酒石酸與乙醇δ13CVPDB的差值和比值。實驗結(jié)果見圖5與圖6。

圖5 16個真實樣品差值模型分布圖Fig.5 The distribution of 16 true samples in difference model

圖6 16個真實樣品比值模型分布圖Fig.6 The distribution of 16 true samples in ratio model

由圖5可知，在差值模型中，有7個完全無添加葡萄酒樣品的差值處于(-5.20±0.39)‰范圍內(nèi)，有4個添加乙醇的樣品處于該范圍外，差值模型識別正確率為68.75%。由圖6可知，在比值模型中，7個完全無添加葡萄酒樣品的比值處于1.23±0.02范圍內(nèi)，有6個添加乙醇的樣品處于該范圍外，比值模型識別率達到81.25%。由于真實樣品數(shù)量極為有限，只能初步表明，比值模型與差值模型具有顯著性差異(p<0.05)，乙醇與酒石酸δ13CVPDB比值模型識別率更高，比值的規(guī)律性研究可應(yīng)用于驗證“非添加”葡萄酒中是否有外源添加的乙醇。需要說明的是，若樣品滿足此模型，不能完全說明該樣品一定為“非添加”葡萄酒，可能存在摻入乙醇后其同位素值仍然滿足該模型的情況；而不滿足該模型的樣品，說明其具有摻假行為，具體摻入物質(zhì)定性與定量分析還需進一步討論。

2.5 市售葡萄酒的測定結(jié)果與分析

收集2個標識為有機葡萄酒的樣品(完全無添加)(1#～2#)。測定結(jié)果在比值模型中的分布如圖7所示。1號樣品符合比值模型，認為該樣品無外源乙醇摻入；2號樣品不符合比值模型，為可疑樣品，認為樣品生產(chǎn)過程中存在摻入行為。由于本模型未探究外源乙醇摻入量與模型比值的關(guān)系，同時考慮到檢測的不確定度，因此具體摻入物質(zhì)的含量無法得出，需要進一步探討。

圖7 2個葡萄酒樣品乙醇與酒石酸δ13CVPDB比值分布Fig.7 The distribution of 2 wines samples in ratio model

3 討論

本實驗探究了葡萄汁中總糖、酒石酸，以及發(fā)酵液中乙醇、酒石酸的δ13CVPDB值分布特征，及其之間的相關(guān)性規(guī)律。葡萄汁中，酒石酸δ13CVPDB比總糖偏正，但與后者呈現(xiàn)良好線性正相關(guān)關(guān)系(R2=0.94)，模擬摻糖試驗則驗證了此相關(guān)性可用于檢測葡萄汁中外源添加C4植物糖。在發(fā)酵液中，酒石酸δ13CVPDB值不變，乙醇δ13CVPDB值與原料葡萄汁總糖具有明顯的正相關(guān)性(R2=0.98)，既然在葡萄汁中，酒石酸可作為總糖的內(nèi)標物，則酒石酸與乙醇之間必然存在良好相關(guān)性(R2=0.96)。模擬摻乙醇試驗驗證了此相關(guān)性可驗證“完全無添加”葡萄酒中是否添加外源乙醇。初步建立了葡萄酒中乙醇與酒石酸的比值模型和差值模型，結(jié)果表明比值模型識別率更高。

本試驗雖然證明了在無外源糖添加條件下，酒精發(fā)酵過程中酒石酸碳同位素特征不變，但是為實現(xiàn)檢測葡萄酒在發(fā)酵前是否添加外源糖，需要進一步驗證酒石酸碳同位素值是否受發(fā)酵前添加外源糖的影響，即設(shè)計試驗添加C4糖后發(fā)酵再測定，這也是接下來研究的重點。

需要說明的是本研究僅調(diào)查分析了部分產(chǎn)區(qū)的葡萄樣品及葡萄酒特征，由于植物糖分、有機酸中碳同位素分布受眾多因素影響，選擇酒石酸δ13CVPDB值作為乙醇內(nèi)標物建立數(shù)學模型還需詳盡數(shù)據(jù)作為應(yīng)用基礎(chǔ)。