干旱脅迫下3種類型新疆野核桃保護(hù)酶和丙二醛含量的變化

余 甜， 張 萍， 陳韋多

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院/新疆教育廳干旱區(qū)林業(yè)生態(tài)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052)

世界上有1/3以上的土地處于干旱、半干旱地區(qū)，而非干旱地區(qū)在植物生長季節(jié)也常發(fā)生不同程度的干旱[1]，干旱已成為世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要現(xiàn)象之一。目前，對植物耐旱機制的研究日益受到重視，且多集中在干旱脅迫時植物的生理生化反應(yīng)及相應(yīng)的適應(yīng)性機制[2-3]。在長期進(jìn)化過程中，植物形成保護(hù)系統(tǒng)以清除活性氧，減輕或避免活性氧對細(xì)胞造成的傷害，而抗氧化酶系的表達(dá)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累提高了植物的抗逆性，最終體現(xiàn)為植物對干旱脅迫的抗性[4-5]。

新疆野核桃(Juqlans regia)屬胡桃科、胡桃屬植物，既是珍稀野生林木資源，又是世界上稀有的野生核桃資源，中國僅在新疆維吾爾自治區(qū)伊犁鞏留縣野核桃溝有成片分布，并經(jīng)考證認(rèn)為是栽培核桃的直系祖先[6-7]，按種子特征主要劃分為14個類型[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，影響新疆野核桃生長繁衍的限制因素主要是生境溫度和濕度[9-10]。本試驗以卵圓形、尖嘴形、心形3種類型新疆野核桃為研究對象，測定干旱脅迫下新疆野核桃苗期葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量，初步比較3種新疆野核桃在干旱脅迫下的生理反應(yīng)差異，確定其適生水分范圍，為新疆野核桃的進(jìn)一步保護(hù)性開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗處理

采集種子表型特征差異明顯，在新疆野核桃溝存活株數(shù)較多，且在各生長區(qū)域有一定數(shù)量分布的卵圓形、尖嘴形、心形3種類型新疆野核桃種子，單株取樣，按不同類型混合；當(dāng)年11月播種于花盆內(nèi)，并在位于新疆烏魯木齊縣水西溝的陽光溫室內(nèi)培養(yǎng)；次年7月，每個類型隨機選取50株盆栽1年生新疆野核桃實生幼苗，在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實驗室內(nèi)進(jìn)行持續(xù)自然干旱處理，處理前澆足量水，使每株幼苗土壤水分達(dá)到相對飽和狀態(tài)，后直到試驗結(jié)束不再澆水；每隔 5d，即分別在試驗后0(剛灌完水，CK)、5、10、15、20、25d及復(fù)水10d，于08：00隨機選取新疆野核桃實生幼苗中上部的成熟葉片，測定葉片的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量等指標(biāo)。

1.2 各指標(biāo)的測定方法

1.2.1CAT活性 參照鄒琦的方法[11]進(jìn)行：新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.05mL，加入1.5mL磷酸緩沖液，再加 1mL蒸餾水；逐管加入0.1mol/LH2O20.45mL，迅速倒入石英杯中，測定波長為240nm處的吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共讀數(shù)5次；計算CAT活性，公式為：

CAT活性=(D240 nm×VT)/(0.1×V1×t×m)。

式中：D240 nm為波長240nm的吸光度；VT為提取酶粗液的總體積，mL；V1為測定時用的酶體積，mL；t為開始加H2O2到最后1次的讀數(shù)時間，min；m為葉片鮮質(zhì)量，g。

1.2.2POD活性 參照李合生等的方法[12]進(jìn)行：試管中依次加入磷酸緩沖液2mL、2%H2O20.2mL、愈創(chuàng)木酚 0.5mL，最后加入新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.1mL，水浴鍋中34 ℃保溫1min；取出，測定波長為470nm處的吸光度，每隔0.5min讀數(shù)1次，共讀數(shù)5次；計算POD活性，公式為：

POD活性=(ΔD470 nm×VT)/(0.01×VS×t×m)。

式中：ΔD470 nm為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；VT為總提取液體積，mL；m為葉片鮮質(zhì)量，g；VS為測定時使用的酶液體積，mL；t為反應(yīng)時間，min。

1.2.3SOD活性 參照李合生等的方法[12]進(jìn)行：試管中依次加入磷酸緩沖液1.5mL、甲硫氨酸(Met)0.3mL、氮藍(lán)四唑(NBT)0.3mL、乙二胺四乙酸鈉(EDTA-Na2)0.3mL、0.25mL蒸餾水、稀釋5倍的核黃素0.3mL，最后加入新疆野核桃幼苗葉片提取酶液0.05mL，置于4 000lx日光下反應(yīng) 6min，以暗處理的樣品為空白對照，測定波長為560nm處的吸光度，計算SOD活性，公式為：

SOD活性=(D0-Ds)×VT/(0.5×D0×V1×t×m)。

式中：D0為空白對照的吸光度；Ds為樣品管的吸光度值；VT為樣品液的總體積，mL；m為樣品鮮質(zhì)量，g；V1為測定時提取液用量，mL；t為反應(yīng)時間，min。

1.2.4MDA含量 稱取樣品2g，加入10%三氯乙酸2mL，研磨至勻漿，再加入10%三氯乙酸8mL進(jìn)一步研磨，勻漿 4 000r/min離心10min；吸取上清液2mL，加入0.6%硫代巴比妥酸溶液2mL，以加入2mL蒸餾水為對照，混勻，沸水浴反應(yīng)15min；迅速冷卻，離心，取上清液，分別測定波長為532、600、450nm處的吸光度，計算MDA含量，公式為：

MDA含量=[6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56×D450 nm]×V/m。

式中：D532nm、D600 nm、D450 nm分別為波長532、600、450nm處的吸光度；V為樣品液的總體積，mL；m為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel2010、SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下新疆野核桃葉片CAT活性的變化

由表1可知，干旱脅迫處理0～10d，3種類型新疆野核桃葉片CAT活性增長較為緩慢；脅迫處理10～20d，3種類型新疆野核桃葉片CAT活性增長較為迅速；脅迫處理20d時，卵圓形、尖嘴形、心形野核桃的CAT活性分別為235.33、151.66、131.00U/(g·min)，其中卵圓形野核桃的CAT活性顯著高于其他2個類型野核桃(P<0.05)；卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的CAT活性在脅迫處理20d時達(dá)到最大值，脅迫處理25d時急劇下降，而心形野核桃在脅迫處理25d時達(dá)到最大值，為170.66U/(g·min)，心形野核桃的CAT反應(yīng)受干旱脅迫時間相比前兩者較長；復(fù)水10d，尖嘴形、卵圓形野核桃葉片的CAT活性分別為52.00、34.66U/(g·min)。

表1 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的CAT活性

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2 干旱脅迫下新疆野核桃葉片POD活性的變化

由表2可知，干旱脅迫處理0～5 d，3種類型新疆野核桃葉片的POD活性變化不大，在50 U/(g·min)左右，呈緩慢上升趨勢；脅迫處理5～20 d，3種類型野核桃葉片的POD活性急劇上升，其中心形野核桃葉片POD活性增長幅度相對最大，其次是卵圓形，尖嘴形野核桃葉片POD活性增長相對最慢；脅迫處理20 d時，3種類型野核桃葉片POD活性相互間有顯著性差異(P<0.05)；脅迫處理20～25 d，心形野核桃葉片POD活性依然呈增長趨勢，且在脅迫處理25 d時達(dá)到峰值，為222.80 U/(g·min)，而卵圓形和尖嘴形野核桃葉片POD活性均呈下降趨勢；脅迫處理25 d時，卵圓形野核桃葉片的POD活性降到2.00 U/(g·min)；心形野核桃葉片POD活性在復(fù)水10 d時相對最低，為7.40 U/(g·min)。

表2 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的POD活性

2.3 干旱脅迫下新疆野核桃葉片SOD活性的變化

SOD是一種重要的活性氧清除酶，當(dāng)外來脅迫導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生時，SOD能及時有效清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受活性氧脅迫的傷害[13]。由表3可知，干旱脅迫處理0～10 d，尖嘴形、心形野核桃葉片的SOD活性增加速度相對較慢，而卵圓形野核桃葉片的SOD活性增長速度相對較快；脅迫處理5 d時，卵圓形野核桃葉片SOD活性顯著低于其他2種類型(P<0.05)；脅迫處理10～20 d，卵圓形和尖嘴形野核桃葉片的SOD活性增長非常接近，有幾乎相同的變化趨勢，而心形野核桃葉片的SOD活性增長速度稍為緩慢；卵圓形野核桃葉片的SOD活性在脅迫處理20 d時達(dá)到峰值，而其他2種類型野核桃在脅迫處理25 d時達(dá)到峰值；復(fù)水10 d，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的SOD活性有明顯的下降。

表3 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的SOD活性

2.4 干旱脅迫下新疆野核桃葉片丙二醛含量的變化

植物體內(nèi)的膜脂過氧化產(chǎn)物積累與植物受逆境傷害程度呈正比關(guān)系，植物受傷害程度越小，則丙二醛積累量越?。环粗?，則丙二醛含量越大[14]。由表4可知，隨脅迫天數(shù)的增加，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈先上升后下降趨勢，而心形野核桃葉片丙二醛含量呈持續(xù)上升趨勢；干旱脅迫處理15～20 d，卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈明顯上升趨勢，且在脅迫處理20 d時達(dá)到峰值；心形野核桃葉片丙二醛含量在脅迫處理25 d時達(dá)到峰值，為 26.66 μmol/g，與其他2個類型野核桃葉片丙二醛含量相比有顯著性差異(P<0.05)；復(fù)水10 d，3種類型野核桃葉片的丙二醛含量都有不同程度的下降。

表4 干旱脅迫下3種類型新疆野核桃葉片的MDA含量

3 結(jié)論與討論

野生植物資源是重要的遺傳資源，是未來人類能夠利用的資源[8]。新疆野核桃在我國主要分布于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁鞏留野核桃溝內(nèi)，是極為珍稀的野生資源，對育種和栽培核桃的起源、演化研究具有重要的價值。王肇延研究表明，新疆野核桃對生存的環(huán)境要求較高，而新疆氣候干燥、降水量少的特點時刻威脅著新疆各類野生果樹的生存[10]。因此，研究新疆野核桃在干旱環(huán)境下的生理適應(yīng)性反應(yīng)，對新疆野核桃未來的研究利用有著重大意義。

植物保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等，相互間可協(xié)同作用，使氧自由基維持在一個較低的水平上，從而防止氧自由基對生物體造成傷害，目前已廣泛用于植物對逆境的反應(yīng)機制研究[15]。過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，其活性與植物的代謝強度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系；過氧化物酶是植物體中活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系，可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。超氧化物歧化酶是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫的酶[16]，是生物體內(nèi)一種很重要的抗氧化酶類，有很好的科研意義和應(yīng)用價值[17]。試驗結(jié)果表明，卵圓形、尖嘴形2種類型的新疆野核桃葉片CAT活性在干旱脅迫處理20 d時達(dá)到最大值，后開始下降，心形新疆野核桃葉片CAT活性在干旱脅迫處理25 d時達(dá)到最大值，說明心形野核桃抗旱能力較強；3種類型新疆野核桃葉片POD活性在脅迫初期呈緩慢增長趨勢，說明植物對干旱脅迫有一個適應(yīng)調(diào)節(jié)的過程，而其變化幅度大小說明植物調(diào)節(jié)能力的強弱；脅迫處理25 d至復(fù)水10 d，卵圓形野核桃葉片的POD活性繼續(xù)上升，說明干旱脅迫程度已達(dá)到飽和，POD活性不再發(fā)揮作用；干旱脅迫初期，卵圓形野核桃葉片的SOD活性增加速度相對較快，其余兩者增長速度較慢，植株通過體內(nèi)SOD活性上升來抵御逆境，使植物不受或受到較小傷害；干旱脅迫期間，尖嘴形、心形新疆野核桃葉片SOD活性呈持續(xù)上升狀態(tài)，表明這2種新疆野核桃有較強的抗旱性。

丙二醛是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一，其含量高低可一定程度上反映植物受氧化傷害的程度[18-19]。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫過程中，心形野核桃葉片的丙二醛含量呈上升趨勢，直至復(fù)水10 d下降，而卵圓形、尖嘴形野核桃葉片的丙二醛含量呈先上升后下降趨勢，脅迫處理20 d時達(dá)到峰值，說明心形野核桃的抗逆性較尖嘴形、卵圓形抗逆性強。

從整體來看，心形野核桃過氧化過程相對較慢，細(xì)胞膜穩(wěn)定性較高，抗旱性較強，尖嘴形野核桃調(diào)節(jié)自身抗氧化酶活性的能力居中，而卵圓形野核桃參與滲透調(diào)節(jié)能力消耗相對較大，調(diào)節(jié)自身抗氧化能力相對較弱；3種野核桃抗旱性強弱依次為心形>尖嘴形>卵圓形。