姜雪亞，陳俊輝，魏東

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

蝦青素（Astaxanthin），化學名稱為3,3’-二羥基 -4,4’-二酮基-β’β-胡蘿卜素，是一種酮式類胡蘿卜素。蝦青素巨大的經(jīng)濟應用價值在于其具有超高的抗氧化活性，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的10倍，維生素E的500倍，被譽為“超級維生素E”，可延緩皮膚衰老、提高機體免疫力等，因而在化妝品、醫(yī)藥等方面具有較好的應用前景[1～3]。蝦青素的來源主要包括化學合成與天然提取，而天然提取的蝦青素在穩(wěn)定性、安全性和抗氧化性等明顯優(yōu)于合成蝦青素。

天然蝦青素的來源主要有三方面：從甲殼類動物中提取、從真菌或細菌中獲得、從藻類細胞提取[4]。雨生紅球藻被認為是生產(chǎn)天然蝦青素的最佳來源，但是其缺點是細胞產(chǎn)率低、生長遲緩、易污染等，而色綠藻因其生長速率快、細胞產(chǎn)率高，不易污染等，因而近年來色綠藻被認為是大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的潛在選擇。

色綠藻Chromochloris zofingiensis是一種淡水單細胞綠藻，細胞直徑范圍2～15 μm，通過無性繁殖形成孢子分裂產(chǎn)生子細胞[5]。色綠藻既進行光自養(yǎng)，亦可以利用有機碳源進行異養(yǎng)，同時還可以利用光照與有機碳源進行混養(yǎng)生長。色綠藻胞內(nèi)富含多種高價值的產(chǎn)物如初級類胡蘿卜（主要包括葉黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)等）、次級類胡蘿卜素（主要包括蝦青素、角黃質(zhì)和金盞花黃質(zhì)等）以及用于光合作用的葉綠素，因而近年來色綠藻受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。

目前國內(nèi)外對于色綠藻培養(yǎng)的研究大多集中在異養(yǎng)發(fā)酵方面，對于混養(yǎng)方便報道相對較少，但是混養(yǎng)條件下色綠藻的生物量濃度、生長速率均高于異養(yǎng)條件下的培養(yǎng)[6]。本實驗則是選擇混養(yǎng)條件下進行實驗，主要分析了混養(yǎng)條件下，五種不同氮源種類、葡萄糖濃度和碳氮比對色綠藻生長和蝦青素積累的影響，以期獲得最高生物量濃度和相對較高的蝦青素含量。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藻種

本實驗所采用的色綠藻（Chromochloris zofingiensisATCC 30412）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器與設備

生物傳感分析儀 SBA-40D購自山東省科學院生物研究所；高效液相分析儀購自美國 Dionex公司；BD Accuri C6流式細胞儀購自美國 BD 公司；ModulyoD-230冷凍干燥機購自 Thermor Electron Corporation；GLZ-A光量子計購自浙江托普儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備

從改良 Bristol’s medium[7]斜面上挑取一小環(huán)色綠藻藻苔，轉(zhuǎn)接到含有 10 g/L 葡萄糖的 Bristol’s medium的平板上。在光照為 10 μmol/(m2·s)，溫度為 26 ℃的條件下，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。再從培養(yǎng)基平板上挑取一個單藻落，接種至含有 10 g/L葡萄糖的Bristol’s medium 中，在光照為 10 μmol/(m2·s)、溫度為26 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min 的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d。

1.2.2 不同氮源種類對色綠藻生物量以及色素積累的影響

以不含氮源的Bristol’s medium為基本培養(yǎng)基，在同一葡萄糖濃度（30 g/L）條件下，按照相同的碳氮比（C/N比為34）在培養(yǎng)基中分別加入硝酸鈉、胰蛋白胨、酵母膏、尿素、碳酸氫銨。每組設三個平行，并將pH調(diào)至6.50，分裝至250 mL的三角瓶中，裝液量為 100 mL，在 121 ℃條件下滅菌15 min。按照 10%的接種量進行接種，在光照為 10 μmol/(m2·s)，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為 150 r/min 的條件下培養(yǎng) 8 d。

1.2.3 不同低碳氮比碳氮比對色綠藻生物量以及色素積累的影響

以不含氮源的Bristol’s medium為基本培養(yǎng)基，初始葡萄糖濃度為20 g/L，按照碳氮比分別為22、34、42加入硝酸鈉，每組三個平行，進行試驗。將pH調(diào)至6.50、分裝并在 121 ℃條件下滅菌 15 min。按照10%的接種量進行接種，在光照為 10 μmol/(m2·s)、溫度為26 ℃、轉(zhuǎn)速為 150 r/min 的條件下培養(yǎng) 8 d。

1.2.4 不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻生物量以及色素積累的影響

以不含氮源的Bristol’s medium為基本培養(yǎng)基，以葡萄糖、硝酸鈉作為唯一碳氮源。在培養(yǎng)基中加入葡萄糖濃度(以下簡寫為 Glu.)分別為 10 g/L、20 g/L、30 g/L，同時每組葡萄糖濃度條件下按照碳氮比為 22、34，分別加入硝酸鈉，共六組實驗，其實驗條件設置具體如下：每組葡萄糖濃度（10 g/L、20 g/L、30 g/L）條件下，均設置碳氮比分別為22、34，進行實驗。

調(diào)節(jié)pH至6.50并分裝，裝液量為100 mL，在121 ℃條件下滅菌15 min。在接種量為10%，光照為10 μmol/(m2·s)、溫度為 26 ℃、轉(zhuǎn)速為 150 r/min 的條件下培養(yǎng) 8 d。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量濃度的測定[8]

色綠藻生物量采取干重法進行測定。吸取 2 mL色綠藻培養(yǎng)液，置于干燥已稱重的2 mL離心管中，離心、洗滌。將上清液與藻泥分離，將藻泥置于真空干燥箱中在60 ℃烘干至恒重，用分析天平稱量并計算差值，每個樣品重復測三次，取平均值。

1.3.2 干重得率（g/g）

干重得率α=(m1-m2)/(x1-x2)

其中：m1、m2為t1、t2時間對應的生物量濃度，x1、x2為t1、t2時間對應的葡萄糖濃度。

1.3.3 細胞的平均比生長速率

平均比生長速率的計算方法參考梁英等人的計算方法[9]。

1.3.4 葡萄糖濃度的測定

采用 SBA生物傳感分析儀測定培養(yǎng)過程中的葡萄糖濃度。SBA校正量程為0.5～1.0 g/L[8]。測定前用1.0 g/L的葡萄糖標準品定標，取待測上清液，稀釋至量程范圍內(nèi)，并移取25 μL樣品進行測定。測定讀數(shù)×稀釋倍數(shù)即為每個樣品的葡萄糖濃度。

1.3.5 總氮的測定

總氮（Total Nitrogen，TN）的測定采用購自哈希公司的DRB 200消解器和DR 2700分光光度計測定，其中DR 2700分光光度計的校正量程為0.5～25 mg/L與2～150 mg/L，取待測上清液，稀釋至校正量程內(nèi)，將加入Total Nitrogen Persulfate粉枕包的空白樣與待測樣置于DRB 200消解器中進行消解30 min，待冷卻至室溫后，加粉劑包(TNA、TNB)反應后，用DR 2700分光光度計測定。

1.3.6 細胞密度的測定

色綠藻細胞密度采取流式細胞儀測定，吸取1 mL培養(yǎng)過程中的藻液，稀釋至校正量程。流式細胞儀測定細胞數(shù)稀釋范圍為700～1000個/μL。測定前樣品要用超純水清洗、過濾。

1.3.7 細胞中的色素的提取以及測定

準確稱量凍干的藻粉10 mg于振蕩管中，并加入適量的研磨珠。加入1 mL含有0.1%(m/V)的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）的甲醇與二氯甲烷提取溶劑（3:1，V/V），高速振蕩30 s，之后迅速置于液氮中冷卻，離心收集上清液。如此反復提取直至藻細胞變成無色。收集上清液，用氮氣吹干，加入1 mL甲醇與甲基叔丁基醚（MTBE）混合溶劑（1:1，V/V）定容。最后用0.22 μm的微孔有機濾膜進行過濾，轉(zhuǎn)至棕色瓶中，低溫保存用于液相分析。以上所有操作要在避光的條件下進行，以避免操作過程中色素被降解。色素含量的測定參照參考文獻的液相測定方法進行測定[10]。色素校準品蝦青素（41659）、葉綠素a（96145）、葉綠素b（00538）、葉黃素（07168）、角黃素（11775）均購自美國Sigma-Aldrich公司，將上述色素校準品配制成不同濃度的標準溶液，依據(jù)上述HPLC的測定條件，建立相應的色素標準曲線，進而進行樣品中色素含量的定性和定量分析測定。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 Microcal Origin 9.0 Software、SPSS 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同氮源對色綠藻生物量濃度與色綠藻色素含量的影響

2.1.1 不同氮源對色綠藻生物量濃度影響

圖1 不同氮源條件下色綠藻的生長曲線(a)以及葡萄糖的消耗曲線(b)Fig.1 Biomass concentrations (a) and time courses of glucose concentrations (b) in the cultures of C. zofingiensis with different nitrogen sources

不同氮源種類對色綠藻生長過程中葡萄糖消耗以及生物量濃度的影響如圖1所示。如圖1b所示，細胞生長初期葡萄糖消耗變化曲線基本一致，主要由于此時細胞生長處于延滯期，從第 2～6 d，葡萄糖消耗迅速，此時細胞處于對數(shù)增長期。而其中硝酸鈉實驗組消耗最快，葡萄糖在第8 d基本消耗完全。如圖1a所示，在以硝酸鈉為氮源的條件下，色綠藻生物量濃度顯著優(yōu)于其他四組（p＜0.05）且硝酸鈉組的生物量濃度最高可達到9.23 g/L。楊勛等人的研究了在以硝酸鈉、尿素、氯化銨為氮源對色綠藻的生長的影響，其研究結(jié)果表明，培養(yǎng)時間為8 d時，硝酸鈉組生物量濃度最優(yōu)，與本實驗結(jié)果類似[11]。而王忠明等人研究則是認為尿素是色綠藻的最佳氮源，且低濃度的尿素利于藻類生長[12]。與本實驗結(jié)果產(chǎn)生差異主要原因可能由于尿素濃度以及培養(yǎng)基的差異。

圖2 不同氮源條件下色綠藻總氮利用率(a)以及pH的變化曲線(b)Fig.2 Total nitrogen utilization (a) and time courses of pH (b) in the cultures of C. zofingiensis with different nitrogen sources

不同氮源種類對色綠藻生長過程中總氮的利用率如圖2a所示，總氮利用率從高至低為硝酸鈉＞酵母膏≈碳酸氫銨＞尿素＞胰蛋白胨，利用SPSS進行分析，以硝酸鈉為氮源時消耗量顯著高于其他處理組（p＜0.05），因此實驗結(jié)果表明色綠藻對硝態(tài)氮的利用率較高。

研究表明色綠藻生長的pH范圍是5.5～8.5[5]，由圖2b所示，以硝酸鈉為氮源，其pH值的變化處于適宜范圍內(nèi)，這也可能是硝酸鈉實驗組優(yōu)于其他的原因之一。以碳酸氫銨為氮源時，pH一直處于增長狀態(tài)，超過色綠藻生長的pH范圍，不利于藻細胞生長，不適宜作為色綠藻的氮源，且碳酸氫銨極不穩(wěn)定受熱遇光分解。其他三組實驗的pH變化處于先降低后趨于穩(wěn)定，這可能由于此時光合作用變化的影響，光合作用減弱會引起藻類pH降低，而且三者的pH的變化范圍低于色綠藻生長的pH范圍，這也是其生物量濃度相對較低的原因之一。

如圖1a所示，色綠藻前6 d生長速率較快，在第6 d之后生長基本趨于穩(wěn)定。王天鵬等人研究了異養(yǎng)、混養(yǎng)條件下色綠藻的生長變化，與本實驗研究結(jié)果基本一致[6]。

培養(yǎng)結(jié)束時干重得率如表1所示，由統(tǒng)計檢驗得到，硝酸鈉組與酵母膏組的干重得率無顯著性差異，但是硝酸鈉組與其他組有極顯著差異（p＜0.05），結(jié)合圖2a，實驗結(jié)果表明，以硝酸鈉為氮源的條件下，色綠藻能夠獲得更高的生物量濃度。綜上，最適宜色綠藻生長的氮源為硝酸鈉，其次是酵母膏、尿素、胰蛋白胨，而碳酸氫銨不利于色綠藻的生長。

表1 不同氮源種類條件下的色綠藻干重得率及平均比生長速率Table 1 Yield ratios of biomass to glucose and specific growth rate of C. zofingiensis in the cultures with different nitrogen sources

2.1.2 不同氮源條件下對色綠藻積累色素的影響

圖3 色綠藻培養(yǎng)過程中的顏色變化Fig.3 Color changes of C. zofingiensis during different culture stages

色綠藻含有葉綠素a和葉綠素b，合成并積累初級類胡蘿卜素（如β-類胡蘿卜素、葉黃素等）以及次級類胡蘿卜素色綠藻（如蝦青素、角黃素等），研究表明，色綠藻在綠色細胞階段主要以葉綠素a、葉綠素b、葉黃素為主[13]，而蝦青素則在紅色細胞階段積累含量較高。本實驗培養(yǎng)期間藻細胞的變化如圖3所示。不同氮源條件下對色綠藻積累蝦青素及其他色素的影響如圖4a所示。

圖4 不同氮源種類對色綠藻色素含量（a）及色素所占百分比（b）的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the pigment accumulation(a)and percent of pigments(b)of C. zofingiensis

由圖4可知，蝦青素的含量由高至低依次為胰蛋白胨＞硝酸鈉≈酵母膏≈尿素＞碳酸氫銨，其中胰蛋白胨組蝦青素含量最高可達到2.24 mg/g，產(chǎn)量可達16.13 mg/L（如表2所示），蝦青素所占總類胡蘿卜色素比例為 60.78%；而硝酸鈉組蝦青素組含量最高可達到1.34 mg/g，產(chǎn)量可達12.38 mg/L，蝦青素所占總類胡蘿卜素的比例為46.94%。如圖4a、4b所示，培養(yǎng)結(jié)束時，色綠藻雖為紅色細胞狀態(tài)（如圖3所示），但是其積累的色素仍以葉綠素（包括葉綠素a、葉綠素b）為主，五組實驗葉綠素占總色素含量的50%以上，其中硝酸鈉組葉綠素所占比例最大約為60%，而此時蝦青素所占總色素的19.30%，劉學銘等[14]人研究表明隨著葉綠素含量增加，生長速度加快，最終生物量與葉綠素含量呈現(xiàn)正相關。這也是硝酸鈉組生物量遠高于其他組的原因之一。以硝酸鈉、胰蛋白胨為氮源時，葉黃素含量較高，且無顯著相差異，其中以硝酸鈉為氮源時，葉黃素含量可達到 1.37 mg/g，產(chǎn)量最高為12.64 mg/L，且葉黃素的含量約占總色素含量的19.10%。五組實驗條件下，角黃素的含量均相對較少，其占總色素百分比不超過5%，如圖4b所示。

不同氮源種類條件下，色素含量從高至低依次為葉綠素、蝦青素、葉黃素、角黃素，而角黃素含量最少。綜上，以胰蛋白胨為氮源時，色綠藻積累蝦青素含量最高為2.24 mg/g，但是生物量濃度為7.20 g/L；以硝酸鈉為氮源時，色綠藻積累蝦青素的含量為1.34 mg/g，占總類胡蘿卜素的46.94%，但生物量濃度最高為9.23 g/L；而以碳酸氫銨為氮源時，幾種色素含量均是較少，且生物量亦是最少，因此碳酸氫銨不利于色綠藻的生長以及色素的積累。

表2 不同氮源種類條件下色綠藻的色素產(chǎn)量、產(chǎn)率及蝦青素所占總類胡蘿卜素的百分比Table 2 Pigment yield, productivity and percentage of astaxanthin in total carotenoids of C. zofingiensis in the cultures with different nitrogen sources

2.2 不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻生物量以及色素積累的影響

2.2.1 不同碳氮比對色綠藻生物量濃度的影響

不同碳氮比對色綠藻生物量的影響如圖5a所示，實驗結(jié)果表明在碳氮比不同的情況下，隨著碳氮比的降低，色綠藻的生物量濃度呈現(xiàn)先升高后降低，葡萄糖的消耗量逐漸降低（如圖 5b所示），碳氮比為 22時，生物量濃度為8.08 g/L，剩余葡萄糖濃度是最低即是對葡萄糖利用率較高，但總氮的利用率顯著低于其他兩組（p＜0.05）。

當碳氮比為42時，生物量濃度最低為5.70 g/L。當碳氮比為34時，生物量濃度為8.35 g/L且對總氮的利用率顯著較高。

綜上，當碳氮比高于34時，生物量濃度會顯著降低（p＜0.05），培養(yǎng)基中剩余葡萄糖濃度會隨著碳氮比升高而增加，總氮利用率隨著碳氮比的升高呈現(xiàn)先增大后減小。

圖5 不同碳氮比條件下色綠藻的生物量（a）、葡萄糖的剩余量（b）及總氮利用率（c）Fig.5 Biomass concentrations(a), residue glucose concentrations(b) and total nitrogen utilization (c) of C.zofingiensis in the cultures with different C/N ratios

表3 不同碳氮比條件下的色綠藻干重得率及平均比生長速率Table 3 Yields of biomass to glucose and specific growth rate ofC. zofingiensis in the cultures with C/N ratios sources

2.2.2 不同低碳氮比對色綠藻積累色素的影響

不同碳氮比對色綠藻積累色素的影響如上圖6所示，如圖6a所示，隨著碳氮比的升高，蝦青素含量升高，所占總類胡蘿卜素的百分比逐漸升高。當碳氮比為22時，蝦青素含量最低，所占總色素百分比也是最低（如圖6b所示），約占總類胡蘿卜素的35.10%，產(chǎn)量為5.72 mg/L，而當碳氮比為34時，積累的蝦青素約占總類胡蘿卜的40.53%，產(chǎn)量為7.64 mg/L。碳氮比為 42時，積累的蝦青素約占總類胡蘿卜素的58.38%，產(chǎn)量為6.62 mg/L。結(jié)合圖5、表4，實驗結(jié)果表明，在本實驗條件下，隨著碳氮比的升高，蝦青素含量逐漸升高，蝦青素占總類胡蘿卜素的百分比也逐漸升高。

圖6 不同碳氮比對色綠藻色素含量（a）及色素所占總色素百分比（b）的影響Fig.6 Effects of different C/N ratios on the pigment accumulation(a) and pigment percentage(b) of C. zofingiensis under different C/N ratios and glucose concentrations

綜上，本實驗研究不同低碳氮比對色綠藻生物量濃度和積累色素的影響，考慮到后續(xù)高密度快速擴種和蝦青素積累的戶外大規(guī)格培養(yǎng)實驗，因此，此階段的重要技術(shù)指標為生物量濃度、剩余葡萄糖濃度、氮源濃度。因為葡萄糖的剩余會影響后續(xù)戶外培養(yǎng)引起染菌，而總氮余量過高會影響后續(xù)的誘導積累蝦青素。因此選用碳氮比為22和34為最優(yōu)選擇，由于葡萄糖濃度、接種狀態(tài)影響等的影響，二者的生物量濃度并不很高，因此會在后續(xù)試驗中針對這兩種碳氮比條件下的不同葡萄糖濃度進行進一步優(yōu)化篩選。

2.2.3 不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻生物量濃度的影響

圖7 不同葡萄糖濃度和碳氮比條件下色綠藻的生物量（a）、葡萄糖的消耗狀況（b）、細胞數(shù)的變化曲線（c）及總氮利用率（d）Fig.7 Biomass concentrations(a), glucose concentrations(b), cell densities (c) and total nitrogen utilization (d) of C. zofingiensis in the cultures with different glucose concentrations and C/N ratios

上述低碳氮比試驗證明低碳氮比利于生物量濃度的增加，由于后續(xù)高密度快速擴種擴大要求，因此要對上步篩選碳氮比進行進一步的優(yōu)化篩選，以期獲得較高的生物量的濃度，同時培養(yǎng)結(jié)束時剩余葡萄糖濃度較低。不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻生物量濃度以及葡萄糖消耗的影響如圖7所示。在細胞生長延滯期，六組實驗條件下的色綠藻對葡萄糖的消耗速率基本一致。進入對數(shù)期后，在同一碳氮比的條件下，當碳氮比為34時，初始葡萄糖濃度為30 g/L在第8 d消耗完全；當碳氮比為22時，初始葡萄糖濃度分別為20 g/L和10 g/L，兩組的葡萄糖消耗也是在第6 d耗盡，而初始葡萄糖濃度為30 g/L一組在第8 d葡萄糖依然有剩余（7.34 g/L）。如表5所示，利用SPSS分析數(shù)據(jù)，六種實驗條件下的干重得率無顯著性差異，但是當碳氮比34，葡萄糖濃度為30 g/L一組平均比生長速率有顯著性差異（p＜0.05）同時獲得較高生物量（11.28 g/L），可能由于在此條件下色綠藻對葡萄糖的利用率更高。結(jié)合圖7a，實驗結(jié)果表明，在本實驗條件下，當碳氮比相同時，色綠藻生物量濃度隨著初始葡萄糖濃度的增加而增加且在初始葡萄糖濃度為30 g/L時，生物量濃度達到最大，與Po-Fung Ip等人研究結(jié)果類似[7,15]。

如圖7c所示，不同實驗條件下的細胞數(shù)變化曲線如圖所示，生物量濃度最大的兩組即是實驗條件分別為碳氮比為22，葡萄糖濃度為30 g/L和碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L的兩組，但其細胞數(shù)均是相對較少。培養(yǎng)結(jié)束時，實驗條件分別為碳氮比為22，葡萄糖濃度為10 g/L和碳氮比為34，葡萄糖濃度為10 g/L的兩組處于綠色細胞狀態(tài)；而實驗條件分別為碳氮比為22，葡萄糖濃度為20 g/L和碳氮比為34，葡萄糖濃度為20 g/L組處于黃綠色細胞狀態(tài)；實驗條件分別為碳氮比為22，葡萄糖濃度為30 g/L和碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L的兩組則是處于紅色細胞狀態(tài)，而培養(yǎng)過程中細胞顏色的變化主要由于次級類胡蘿卜素特別是蝦青素的合成與積累，這與雨生紅球藻培養(yǎng)過程中顏色變化類似[15～17]。研究報道色綠藻培養(yǎng)過程中紅色細胞體積大于綠色狀態(tài)的細胞，這也可能是在實驗條件均為葡萄糖濃度為30 g/L，碳氮比不同的兩組雖然細胞數(shù)少但生物量濃度卻很大的原因之一[6]。

在不同葡萄糖濃度以及碳氮比的情況下，在培養(yǎng)結(jié)束時色綠藻的生物量濃度如圖7a所示，在實驗條件為碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L時，色綠藻生物量濃度最大，可達到11.28 g/L，而Po-Fung Ip等[15]人研究在混養(yǎng)條件下，葡萄糖濃度為30 g/L時生物量最高達到9.45 g/L。利用SPSS分析，碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L一組的生物量顯著優(yōu)于其他各組（p＜0.05），總氮利用率顯著優(yōu)于碳氮比為 22，葡萄糖濃度為30 g/L一組（p＜0.05），結(jié)果表明，當葡萄糖濃度分別為20 g/L和10 g/L時，在本實驗條件下，同一葡萄糖濃度下，不同碳氮比對色綠藻生物量的影響無顯著性差異；在葡萄糖濃度為30 g/L時，不同碳氮比對色綠藻生物量的影響有顯著性差異（p＜0.05），且葡萄糖濃度為30 g/L、碳氮比為34組條件下的生物量濃度最高為11.28 g/L，此時其總氮利用率為 97.37%（如圖7d所示），平均比生長速率是碳氮比為22、葡萄糖濃度為30 g/L組的1.2倍、葡萄糖濃度為20 g/L條件下的兩組的1.23倍，是葡萄糖濃度為10 g/L條件下的兩組的1.85倍。

綜上，色綠藻在碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L實驗條件下生長最優(yōu)，其生物量濃度達到最大（11.28 g/L），較低碳比優(yōu)化試驗中，生物量濃度提高了35%，平均比生長速率亦是最大（0.32/d）且此條件下色綠藻能夠更好的利用葡萄糖以及氮源。

表4 不同碳氮比條件下色綠藻的色素產(chǎn)量、產(chǎn)率及蝦青素所占總類胡蘿卜素的百分比Table 4 Pigment yield, productivity and percentage of astaxanthin in total carotenoids of C. zofingiensis in the cultures with different C/N ratios

表5 不同碳氮比以及不同葡萄糖濃度條件下色綠藻的干重得率及平均比生長速率Table 5 Yield ratios of biomass to glucose and specific growth rate of C. zofingiensis in the cultures with different under different C/N ratios and glucose concentrations

2.2.4 不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻色素積累的影響

圖8 不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻色素含量（a）及色素所占總色素百分比（b）的影響Fig.8 Effects of different C/N ratios on the pigment accumulation(a) and pigment percentage(b) of C. zofingiensis.in the cultures with different glucose concentrations and C/N ratios

不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻積累蝦青素及其他色素的影響如圖8所示，相同葡萄糖濃度下，碳氮比越高，蝦青素含量越高；相同碳氮比條件下，葡萄糖濃度越高，蝦青素含量越高且在葡萄糖濃度為30 g/L時最大。如表6所示，隨著葡萄糖濃度的增加，當碳氮比為22時，蝦青素含量最高達到1.89 mg/g，產(chǎn)量能達到16.89 mg/L產(chǎn)率為2.11 mg/L/d，其中蝦青素占總類胡蘿卜素比例的57.56%；當碳氮比為34時，蝦青素含量最高達到 1.93 mg/g，產(chǎn)量能達到 21.77 mg/L，產(chǎn)率能達到2.74 mg/L/d，其中蝦青素占總類胡蘿卜素比例的52.71%；同一葡萄糖濃度下，碳氮比越高，蝦青素含量越高；實驗結(jié)果表明在本實驗條件下，提高葡萄糖的濃度能夠促進色綠藻積累蝦青素。與Po-Fung Ip等[7]人研究色綠藻積累蝦青素的研究結(jié)果類似。結(jié)合圖7c，實驗結(jié)果表明：培養(yǎng)結(jié)束后，細胞數(shù)越少，而蝦青素含量反而越高，這與 Zhang等[18]人的研究結(jié)果是一致的，其研究表明當細胞開始緩慢裂解時，開始積蝦青素。

不同葡萄糖濃度以及碳氮比對色綠藻積累葉黃素、角黃素以及葉綠素的影響如表6所示，同一碳氮比條件下，角黃素的含量均是隨著葡萄糖濃度的升高而升高，葉黃素的含量變化則隨著葡萄糖濃度的升高而降低。葉黃素含量在葡萄糖濃度為10 g/L時最大且碳氮比為22時，葉黃素最大可達到2.56 mg/g，此時產(chǎn)量最高可達到11.40 mg/L，占總色素的32.39%。而角黃素含量則是最少，最大值為0.42 mg/g。研究報道氮是組成葉綠素的基本元素，同時氮含量不足會阻礙細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而使得葉綠素下降[19]。同一碳氮比條件下，隨著葡萄糖濃度增加，氮含量降低，從而致使葉綠素含量下降。

綜上，同一碳氮比條件下，蝦青素的含量隨著葡萄糖濃度的升高而升高，且當碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L時蝦青素含量最高為1.93 mg/g，且生物量濃度最高為11.28 g/L，蝦青素產(chǎn)量亦是最高為21.77 mg/L。這為后續(xù)實現(xiàn)色綠藻的高密快速擴種以及蝦青素積累的戶外大規(guī)格培養(yǎng)實驗提供了良好的基礎。

表6 不同葡萄濃度和碳氮比條件下的色綠藻色素產(chǎn)量、產(chǎn)率及蝦青素所占總類胡蘿卜素的百分比Table 6 Pigment yield, productivity and percentage of astaxanthin in total carotenoids of C. zofingiensis in the cultures with different glucose concentration and C/N ratios

3 結(jié)論

本實驗主要研究了混養(yǎng)條件下，不同氮源種類、葡萄糖濃度、碳氮比對色綠藻生物量濃度以及蝦青素積累的影響結(jié)果。表明混養(yǎng)條件下，硝酸鈉為色綠藻生長所需的最優(yōu)氮源，其次是酵母膏、尿素、胰蛋白胨，而碳酸氫銨不適合作為培養(yǎng)色綠藻的氮源。同時以硝酸鈉為氮源，碳氮比為34，葡萄糖濃度為30 g/L，是色綠藻生長所需的最優(yōu)條件，此時色綠藻可獲得較高的生物量濃度及蝦青素產(chǎn)量，同時能夠較好的利用葡萄糖，為后續(xù)實驗包括高密度快速擴種，誘導實驗及室外大規(guī)模放大實驗奠定基礎。