顧曉川 徐正偉 成鏡 何興輝 華玉偉

摘 要： 為了篩選巴西橡膠體胚植株最為適合的植物凝膠和蔗糖用量，該研究以巴西橡膠樹無(wú)性系熱研7-33-97成熟體細(xì)胞雙子葉次生胚狀體為材料，以添加0.23 μmol·L-1 KT，0.11 μmol·L-1 IAA和8.7 μmol·L-1 GA3的MS培養(yǎng)基為植株再生培養(yǎng)基，研究了添加不同用量的植物凝膠和蔗糖對(duì)巴西橡膠樹體胚植株再生和生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：在橡膠樹體細(xì)胞胚植株再生培養(yǎng)基中，不同用量的植物凝膠對(duì)植株再生頻率和植株生長(zhǎng)狀況有顯著影響，較低濃度（0～1 g·L-1）時(shí)，隨著用量增加，植株再生頻率提高，但較高濃度（1～4 g·L-1）時(shí)，隨著用量增加，植株生長(zhǎng)受到抑制。植物凝膠添加1 g·L-1時(shí)植株生長(zhǎng)最好，植株再生率為（86.4±5.7）%，株高5 cm以上的占（53±9.4）%，帶葉植株為（81.7±3）%；而蔗糖對(duì)植株再生頻率影響不顯著，但對(duì)再生植株生長(zhǎng)的影響顯著，低蔗糖（20～30 g·L-1）時(shí)促進(jìn)植株抽葉但抑制莖干伸長(zhǎng)，高蔗糖（70～80 g·L-1）時(shí)顯著抑制抽葉但促進(jìn)莖干伸長(zhǎng)。蔗糖添加50 g·L-1時(shí)植株生長(zhǎng)最好，株高5 cm以上的占（57.6±5.4）%，株高5 cm以上帶葉植株占（46.3±12.3）%，均為最高且從外觀來(lái)看，在50 g·L-1時(shí)植株莖干和根都較為粗壯。因此，在橡膠樹體細(xì)胞胚植株再生培養(yǎng)基中，植物凝膠和蔗糖最佳用量分別為1 g·L-1和50 g·L-1。

關(guān)鍵詞： 植物凝膠， 蔗糖， 胚狀體， 橡膠樹， 植株再生

中圖分類號(hào)： Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1164-08

Abstract： Phytagel and sucrose have great influence on the regeneration efficiency of somatic embryos and growth of regenerated plants. In this study， effects of phytagel and sucrose on the regeneration of somatic embryos and growth of regenerated plants were carried out on mature cotyledonary embryos from Hevea brasiliensis clone Reyan7-33-97. MS me-dium supplemented with 0.23 μmol·L-1 KT， 0.11 μmol·L-1 IAA and 8.7 μmol·L-1 GA3 was used as the plant regeneration medium. The results showed that appropriate phytagel was helpful for the regeneration efficiency of somatic embryos and growth of regenerated plants. At lower concentrations （0-1 g·L-1）， the frequency of plant regeneration increased with the increase of the amount of phytagel， but at higher concentrations （1-4 g·L-1）， plant growth was inhibited along with the increasing amounts of phytagel. When the phytagel was supplemented in somatic embryo regeneration medium with 1 g·L-1， the plant regeneration rate， the plants （height >5 cm） and the plants with leaves reached （86.4 ± 5.7）%， （53 ± 9.4）% and （81.7 ± 3）%， respectively， higher than other treatments； For sucrose， no effect on the regeneration efficiency of somatic embryos was observed when sucrose was supplemented in somatic embryo regeneration medium， however， significant effects on growth of regenerated plant were observed. When the sucrose was supplemented in somatic embryo regeneration medium with 50 g·L-1， the plants （height >5 cm） and the plants with leaves （height >5 cm） reached （57.6±5.4）% and （46.3±12.3）%， respectively， higher than other treatments， and the stems and roots were very strong from the outside. Moreover， lower sucrose （20-30 g·L-1） promoted the growth of leaves as plant sprouting， but the elongation of stem was supressed， in contrast， higher sucrose （70-80 g·L-1） suppressed the growth of leaves but promoted the elongation of the stem. Overall， the somatic embryo regenaration medium supplimented with 1 g·L-1 phytagel and 50 g·L-1 sucrose was the most approciate for somatic embryo regenaration in H. brasiliensis.

Key words： phytagel， sucrose， embryos， rubber tree， plant regeneration

天然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料。目前天然橡膠主要來(lái)源于巴西橡膠樹膠乳，不同橡膠樹種植材料膠乳產(chǎn)量具有顯著差異。橡膠樹體胚苗是以高產(chǎn)品種花藥或內(nèi)珠被等為外植體，由體細(xì)胞胚直接繁育而來(lái)的新型種植材料。1980年，我國(guó)科學(xué)家王澤云首次在世界上培育出體胚苗植株（王澤云等，1980）。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外大田數(shù)據(jù)顯示體胚苗是一種幼態(tài)化的種植材料，在產(chǎn)量、抗性、一致度等方面都優(yōu)于橡膠樹第一代種植材料（實(shí)生種子苗）和第二代種植材料（老態(tài)芽接苗）（王澤云等，2001；陳雄庭等，2002），是具有推廣應(yīng)用前景的第三代種植材料。華玉偉等（2007）和Hua et al（2010）通過(guò)體細(xì)胞胚循環(huán)增殖，實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞胚的大規(guī)模繁殖。

培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基滲透勢(shì)、體細(xì)胞胚的狀態(tài)和萌發(fā)前的物理處理等因素，均影響體細(xì)胞胚植株再生和植株生長(zhǎng)，其中凝固劑和碳水化合物直接影響培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，對(duì)體胚植株再生和生長(zhǎng)具有顯著影響。較高瓊脂濃度增強(qiáng)培養(yǎng)基保水能力，限制胚狀體對(duì)水分的吸收，使胚狀體含水量下降，從而起到提高胚再生植株頻率的作用。同時(shí)，較高濃度瓊脂可降低試管苗的玻璃化（袁素霞等，2010）。另外，植物凝膠種類和濃度也影響到培養(yǎng)基中鎂、鈣、鋅、錳、鉀離子的有效含量，進(jìn)而影響體細(xì)胞胚植株再生和植株生長(zhǎng)（Li et al，1998）。而蔗糖作為一種滲透調(diào)節(jié)劑和能量，對(duì)體胚成熟和再生具有顯著影響。Becwar & Pullman（1995）認(rèn)為促進(jìn)體細(xì)胞胚萌發(fā)的關(guān)鍵是將胚轉(zhuǎn)入低蔗糖無(wú)激素的萌發(fā)培養(yǎng)基上。同樣，龍眼體胚植株再生時(shí)，高濃度的蔗糖有利于體胚成熟，低濃度蔗糖利于體胚植株再生（賴鐘雄和陳振光，2002）。目前，尚未看到植物凝膠和蔗糖對(duì)橡膠樹體細(xì)胞胚植株再生和植株生長(zhǎng)影響的研究報(bào)道。為此，本研究在橡膠樹體胚植株再生培養(yǎng)基中添加不同用量的植物凝膠和蔗糖，研究它們對(duì)植株再生和生長(zhǎng)影響的同時(shí)，以期篩選巴西橡膠體胚植株最為適合的植物凝膠和蔗糖用量。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為巴西橡膠樹無(wú)性系熱研7-33-97成熟體細(xì)胞雙子葉次生胚狀體，參照Hua et al（2010）的方法培養(yǎng)獲得。

藥品：配制改良MS培養(yǎng)基大量元素、微量元素、鐵鹽所需的藥品和蔗糖，采購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠。配制改良MS培養(yǎng)基有機(jī)成分和植物激素所需的藥品，采購(gòu)于上海生物工程技術(shù)有限公司。植物凝膠采購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。容器：錐形透氣試管根據(jù)專利《一種錐形透氣試管》（專利號(hào)為201320062994.0）進(jìn)行定制。

1.2 方法

將直徑1 cm以上的成熟雙子葉次生胚狀體，接種到裝有植株再生培養(yǎng)基的錐形透氣試管中，28 ℃光照培養(yǎng)，光周期為16 h。接種45 d后統(tǒng)計(jì)植株再生和植株生長(zhǎng)情況。

植株再生培養(yǎng)基為添加0.23 μmol·L-1 KT，0.11 μmol·L-1 IAA和8.7 μmol·L-1 GA3的MS培養(yǎng)基。植物凝膠添加量分別為0～4 g·L-1；蔗糖添加量分別為0～80 g·L-1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，每重復(fù)接種21管，每管接種1個(gè)胚狀體。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

植株再生頻率和生長(zhǎng)情況，通過(guò)植株再生指標(biāo)（抽芽率、生根率和抽芽生根率）和再生植株生長(zhǎng)指標(biāo)（5 cm以上植株率、根長(zhǎng)5 cm以上植株率和帶葉植株率）來(lái)評(píng)價(jià)。抽芽率是指抽芽體胚數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率；生根率是指生根體胚數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率；抽芽生根率是指既抽芽又生根體胚數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率，5 cm以上植株率是指株高5 cm以上植株數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率；根長(zhǎng)5 cm以上植株率是指根長(zhǎng)5 cm以上植株數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率；帶葉植株率是指再生植株中帶葉的植株數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率；5 cm以上帶葉植株率是指株高5 cm以上植株中帶葉植株數(shù)占接種總體胚數(shù)的百分率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS的Ducan法進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物凝膠對(duì)橡膠樹胚狀體植株再生和生長(zhǎng)的影響

對(duì)于植株再生而言，培養(yǎng)基中添加不同用量的植物凝膠，顯著影響胚狀體植株再生。在添加1～4 g·L-1植物凝膠的培養(yǎng)基中，橡膠樹胚狀體的抽芽率、生根率和抽芽生根率均顯著高于添加0～0.5 g·L-1植物凝膠的培養(yǎng)基；在添加1～4 g·L-1植物凝膠的不同培養(yǎng)基中，其抽芽率、生根率和抽芽生根率沒有顯著差異。根據(jù)同樣效果最低濃度原則，橡膠樹胚狀體植株再生培養(yǎng)基植物凝膠的添加量應(yīng)以1 g·L-1為宜，在該濃度下，橡膠樹胚狀體抽芽率86.4%、生根率97.4%、抽芽生根率86.4%，均處于較高水平，說(shuō)明該濃度利于橡膠樹胚狀體植株的再生（表1，圖1）。

對(duì)于再生植株生長(zhǎng)而言，培養(yǎng)基中添加不同用量的植物凝膠，顯著影響再生植株的生長(zhǎng)。在添加1～4 g·L-1植物凝膠的培養(yǎng)基中，5 cm以上植株率和帶葉植株率顯著高于添加0～0.5 g·L-1植物凝膠的培養(yǎng)基，表明植物凝膠用量在1～4 g·L-1時(shí)，有利于再生植株的生長(zhǎng)。但是，過(guò)高植物凝膠用量也影響植株生長(zhǎng)，如植物凝膠添加量1 g·L-1時(shí)，5 cm以上植株率最高，為（53±9.4）%；當(dāng)植物凝膠用量達(dá)4 g·L-1時(shí)，培養(yǎng)物表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)不良、植株矮小、葉片過(guò)早出現(xiàn)黃化和脫落等癥狀，植株生長(zhǎng)全面受到抑制，5 cm以上植株率為0（圖1：F）。綜合株高5 cm以上植株率、根長(zhǎng)5 cm以上植株率和帶葉植株率三個(gè)參數(shù)，培養(yǎng)基中添加1 g·L-1植物凝膠，最利于橡膠樹胚狀體再生植株的生長(zhǎng)。綜合體胚植株再生和再生植株生長(zhǎng)的各種指標(biāo)數(shù)據(jù)，橡膠樹體胚植株再生培養(yǎng)基中添加植物凝膠濃度1 g·L-1時(shí)，既有利于植株再生，又有利于再生植株的生長(zhǎng)。

2.2 蔗糖對(duì)橡膠樹胚狀體植株再生和生長(zhǎng)的影響

對(duì)于植株再生而言，添加蔗糖的培養(yǎng)基，不論是胚狀體植株再生、還是再生植株生長(zhǎng)，均明顯優(yōu)于無(wú)蔗糖培養(yǎng)基。但通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)中，在添加蔗糖5～80 g·L-1的不同培養(yǎng)基中，其胚狀體的抽芽率、生根率、抽芽生根率均沒有顯著差別（表2），表明在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，在含蔗糖培養(yǎng)基中，蔗糖添加量對(duì)橡膠樹胚狀體植株再生頻率沒有顯著影響。

對(duì)于再生植株生長(zhǎng)而言，培養(yǎng)基中添加不同用量的蔗糖，顯著影響胚狀體再生植株的生長(zhǎng)（表2）。首先，隨著蔗糖添加量的增加，5 cm以上植株率有顯著性的增加，在蔗糖80 g·L-1時(shí)達(dá)到了最大值59%；其次，根長(zhǎng)5 cm以上植株率在蔗糖10 g·L-1達(dá)到峰值，且在10～80 g·L-1范圍內(nèi)無(wú)明顯差異；第三，帶葉植株率隨著蔗糖添加量的增加先升高再下降，其峰值為20～40 g·L-1。此外，在植株外觀形態(tài)上，當(dāng)蔗糖較低時(shí)，表現(xiàn)為植株矮小、根系生長(zhǎng)和葉片發(fā)育均受顯著影響，并表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)不良、葉片過(guò)早出現(xiàn)黃化、脫落等癥狀（圖2：a，b，c）；濃度過(guò)高則表現(xiàn)為葉片生長(zhǎng)發(fā)育受抑制（圖2：f）。上述結(jié)果表明，蔗糖作為培養(yǎng)基主要的營(yíng)養(yǎng)成分，在合適的濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)橡膠樹胚狀體再生植株的生長(zhǎng)，主要表現(xiàn)在促進(jìn)株高增加、根系生長(zhǎng)和葉片發(fā)育三個(gè)方面。

為了篩選最為適宜橡膠樹胚狀體再生和植株生長(zhǎng)的蔗糖用量，本研究對(duì)20～80 g·L-1蔗糖用量進(jìn)行了細(xì)化研究（表3），與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似， 低蔗糖時(shí)（20～30 g·L-1）促進(jìn)植株抽葉但抑制莖干伸長(zhǎng)，高蔗糖時(shí)（70～80 g·L-1）顯著抑制抽葉但促進(jìn)莖干伸長(zhǎng)。從體胚植株再生和植株生長(zhǎng)指標(biāo)具體分析來(lái)看，5 cm以上植株率在50 g·L-1時(shí)達(dá)到最大值57.6%，且5 cm以上帶葉植株率在50 g·L-1時(shí)也達(dá)到最大值46.3%。從外觀來(lái)看，在50 g·L-1時(shí)植株莖干和根都較為粗壯（圖3），故蔗糖最適用量為50 g·L-1。

3 討論與結(jié)論

3.1 植物凝膠顯著影響胚狀體植株再生和再生植株的生長(zhǎng)

在植物組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)植株再生需要半固相培養(yǎng)基支撐培養(yǎng)物，凝膠化的培養(yǎng)基可提供半固相培養(yǎng)基，目前有許多種凝固劑可以使培養(yǎng)基凝膠化。植物凝膠是一種比較好的凝固劑，具有通氣性好、凝固溫度低、含雜質(zhì)少、不易發(fā)生玻璃化等優(yōu)點(diǎn)，在許多植物組織培養(yǎng)中的培養(yǎng)效果都優(yōu)于瓊脂，然而植物凝膠的價(jià)格昂貴（張巧等，2010）。在橡膠樹體胚植株再生研究中，gelrite、phytagel和agar等用于植株再生均有報(bào)道，但用量有所不同，對(duì)植株再生頻率影響非常大。Hua et al（2010）在植株再生培養(yǎng)基中添加2.2 g·L-1 植物凝膠，其植株再生頻率達(dá)85.4%。本研究對(duì)植物凝膠用量進(jìn)行詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)植物凝膠添加量為1 g·L-1時(shí)，植株再生頻率達(dá)到最大值（86%），較Hua et al（2010）植株再生頻率略高，是目前再生頻率最高的報(bào)道。同時(shí)，本研究在此用量下，5 cm以上植株率和帶葉植株率顯著高于2.0 g·L-1和其他處理，這說(shuō)明高于最適濃度的植物凝膠在一定程度上會(huì)抑制植株再生和植株生長(zhǎng)。再者，降低植物凝膠用量，也有助于降低種苗的生產(chǎn)成本。

3.2 蔗糖在胚狀體植株再生和再生植株生長(zhǎng)中的作用

碳水化合物在植物組織培養(yǎng)中既作為一種能源和碳源，又是一種滲透劑，被用于植物組織培養(yǎng)的碳水化合物包括各種糖類，經(jīng)比較蔗糖是最佳碳源，葡萄糖、麥芽糖和棉子糖次之，果糖較差，甘露糖和乳糖最差（丁世萍等，1998）。蔗糖濃度對(duì)橡膠樹愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)的影響有過(guò)報(bào)道（王澤云等，1980；陳正華等，1978），蔗糖對(duì)胚狀體植株再生和植株生長(zhǎng)的影響尚無(wú)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖添加量并不影響胚狀體再生效率，如培養(yǎng)基從5～80 g·L-1的抽芽率、長(zhǎng)根率、抽芽長(zhǎng)根率和根長(zhǎng)5 cm以上植株率都沒有顯著性的差別，因此，以往報(bào)道中不同出苗率并非因?yàn)檎崽怯昧恳鸬?；然而? cm以上植株率和帶葉植株率卻有顯著性的差別，表明蔗糖添加量對(duì)橡膠樹胚狀體植株再生的株高和抽葉影響比較大。低濃度的蔗糖添加量（10 g·L-1以下）既不利于植株增高也不利于抽葉，推斷添加量太低時(shí)提供的碳水化合物不能滿足橡膠樹胚狀體生長(zhǎng)的需要；隨著蔗糖添加量的增加植株株高顯著性增高，葉片數(shù)量逐漸減少，80 g·L-1蔗糖用量時(shí)，株高達(dá)到最高，但帶葉植株率達(dá)到最低。推斷可能是培養(yǎng)基中豐富的蔗糖在一定程度上代替了葉片的光合產(chǎn)物，從而無(wú)需葉片的發(fā)育來(lái)提供植株生長(zhǎng)所需能量，蔗糖用量是平衡株高和葉片發(fā)育的關(guān)鍵因素。為此，本研究對(duì)蔗糖用量進(jìn)行了細(xì)化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)橡膠樹體胚植株再生培養(yǎng)基中蔗糖最合適用量為50 g·L-1，在此用量下5 cm以上植株率在50 g·L-1時(shí)達(dá)到最大值57.6%，且5 cm以上帶葉植株率在50 g·L-1時(shí)也達(dá)到最大值46.3%，同時(shí)從外觀來(lái)看，在50 g·L-1時(shí)植株莖干和根都較為粗壯。

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