泌尿道解葡萄糖苷棒狀桿菌的分離、鑒定和藥敏分析

韋柳華 羅國(guó)蘭 李夢(mèng)薇 林盛張 周格琛 鄒燕

中圖分類號(hào) R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）04-0496-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.16

摘 要 目的：對(duì)臨床分離的解葡萄糖苷棒狀桿菌進(jìn)行鑒定和藥敏分析，為臨床用藥提供參考。方法：將從我院泌尿系統(tǒng)結(jié)石致尿路感染患者中段尿標(biāo)本中分離得到的2株菌株接種至哥倫比亞血平板和麥康凱平板上，觀察其生長(zhǎng)情況并計(jì)數(shù)；采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測(cè)菌株的蛋白質(zhì)譜圖；提取菌株DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增其16S核糖體RNA（rRNA）序列，對(duì)片段大小約為1 500 bp的目標(biāo)條帶進(jìn)行雙向測(cè)序，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，鑒定菌種；采用Etest法監(jiān)測(cè)2株菌株的耐藥情況。結(jié)果：2株菌株在哥倫比亞血平板上生長(zhǎng)（菌落數(shù)>105 CFU/mL），在麥康凱平板上不生長(zhǎng)；均為革蘭氏陽(yáng)性棒狀桿菌，多呈柵欄樣或八字形排列。MALDI-TOF-MS鑒定其均為解葡萄糖苷棒狀桿菌，可信度為99.9%，在m/z 2 431、3 089、3 364、3 378、4 200、5 508、6 302、6 637、6 730、6 946、12 603處出現(xiàn)特征峰；Blast比對(duì)結(jié)果顯示，2株菌株與GenBank中已知解葡萄糖苷棒狀桿菌的序列同源性超過(guò)98%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株1對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)青霉素G等其他14種抗菌藥物敏感；菌株2對(duì)頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素耐藥，對(duì)頭孢噻肟中介，對(duì)其他10種抗菌藥物敏感。結(jié)論：2株菌株均為解葡萄糖苷棒狀桿菌，對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性有所差異。該菌為罕見的泌尿道病原菌，且呈多重耐藥，臨床應(yīng)根據(jù)菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物。

關(guān)鍵詞 尿路感染；解葡萄糖苷棒狀桿菌；基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜；鑒定；藥敏試驗(yàn)

ABSTRACT OBJECTIVE： To identify and analyze drug sensitivity of Corynebacterium glucuronolyticum iscolated from clinic， and to provide reference for clinical drug use. METHODS： Two strains isolated from the urine specimens of urolithiasis-induced urinary tract infection patients in our hospital were inoculated into Columbia blood plate and the MacConkey plate. The growth of strains was observed and counted. Protein mass spectrometry of strains was detected by MALDI-TOF-MS. DNA of strains was extracted， and PCR was used to amplify the 16S ribosome RNA （rRNA） sequence. Bi-directional sequencing of 1 500 bp target bands was conducted. Blast comparison between it and GenBank database was conducted to identify bacterial strain. Drug resistance of 2 strains was monitored by Etest assay. RESULTS： Two strains grew on the Columbia blood plate （with colony forming unit >105 CFU/mL） and did not grow on the MacConkey plate. Two strains were Gram-positive Corynebacterium and showed palisading or eight type arrangement. Two strains were C. glucuronolyticum by MALDI-TOF-MS identification， with reliability of 99.9%. The characteristic peaks of m/z 2 431， 3 089， 3 364， 3 378， 4 200， 5 508， 6 302， 6 637， 6 730， 6 946， 12 603 appeared. Blast comparison showed that the sequence homology of 2 strains compared with C. glucuronolyticum strain known in GenBank were higher than 98%. Results of drug sensitivity test showed that strain 1 was resistant to ceftriaxone and ciprofloxacin， and sensitive to 14 other antibiotics as penicillin G； strain 2 was resistant to ceftriaxone， erythromycin， ciprofloxacin， tetracycline and clindamycin， moderately sensitive to cefotaxime， and sensitive to 10 other antibiotics. CONCLUSIONS： Two strains are C. glucuronolyticum， and drug resistance of them to commonly used antibiotics is different. The strains are rare pathogen of urinary tract and show multidrug resistance. Antibiotics should be selected according to the results of strain identification and drug sensitivity test.

KEYWORDS Urinary tract infection； Corynebacterium glucuronolyticum； MALDI-TOF-MS； Identification； Drug sensitivity test

棒狀桿菌是革蘭氏陽(yáng)性、需氧或兼性厭氧桿菌，常定植于人體皮膚和黏膜表面[1]。雖然棒狀桿菌可引起尿路感染，但是由解葡萄糖苷棒狀桿菌引發(fā)的感染極為罕見[2-4]。解葡萄糖苷棒狀桿菌生長(zhǎng)緩慢，容易漏檢（尤其當(dāng)檢出量較小時(shí)），且對(duì)多種抗菌藥物耐藥，給臨床診斷和治療增加了難度[5]。該菌可從有以下易感因素的患者的尿液中分離，包括曾接受過(guò)泌尿系統(tǒng)手術(shù)、長(zhǎng)時(shí)間留置導(dǎo)尿管、住院期間長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物、腎移植術(shù)后行免疫抑制劑治療、發(fā)生全身炎癥反應(yīng)等[6]。若患者出現(xiàn)排尿困難和血尿，尤其是在腎移植或泌尿系統(tǒng)手術(shù)后，建議進(jìn)行解葡萄糖苷棒狀桿菌篩查，以排除其致泌尿道感染的可能，以免延誤診斷和治療時(shí)機(jī)[7]。本文以2例泌尿系統(tǒng)結(jié)石所致尿路感染患者中段尿中分離出的解葡萄糖苷棒狀桿菌作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行分離、鑒定和藥敏試驗(yàn)，以期為臨床診斷和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2株菌株均是從2016年我院泌尿系統(tǒng)結(jié)石致尿路感染患者的中段尿標(biāo)本中分離所得。

1.2 材料

哥倫比亞血平板、麥康凱平板[梅里埃（上海）生物制品有限公司，批號(hào)分別為1004849840、1004820630]；含5%羊血的M-H培養(yǎng)基（溫州康泰生物科技有限公司，批號(hào)：PD200365）；VITEK MS型基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀、靶板（VITEK MS-DS）和基質(zhì)液（VITEK MS-CHCA）以及質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）均由法國(guó)生物梅里埃公司提供；ABI 7500型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型，北京天根生化科技有限公司）；PCR反應(yīng)相關(guān)試劑（包括引物、Taq mix等，美國(guó)Thermo Scientific公司）；16S核糖體RNA（16S rRNA）引物合成由北京六合華大基因公司完成；Alphamager HP型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)ProteinSimple公司）；BX53型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；Etest條由溫州康泰生物科技有限公司提供。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將尿液標(biāo)本混勻，用定量接種環(huán)取上述標(biāo)本各10 μL，分別接種于哥倫比亞血平板和麥康凱平板中，于35 ℃下孵育24～48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.3.2 細(xì)菌計(jì)數(shù) 統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，將菌落數(shù)×102計(jì)為每毫升尿液中所含的細(xì)菌數(shù)（CFU/mL）；若菌落生長(zhǎng)過(guò)多無(wú)法精確計(jì)數(shù)，則計(jì)為>105 CFU/mL。細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）[8]進(jìn)行。

1.4 MALDI-TOF-MS鑒定

用1 μL定量接種環(huán)將質(zhì)控菌株涂布至靶板上的校準(zhǔn)點(diǎn)位，然后取待測(cè)菌株菌落1～2個(gè)，涂布至靶板點(diǎn)位上，每點(diǎn)位各加入基質(zhì)液1 μL，室溫干燥后放入MALDI-TOF-MS儀中，以獲取待測(cè)菌株的全細(xì)胞蛋白質(zhì)譜圖；然后將待測(cè)菌株的質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)庫(kù)已知菌種的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較，獲得鑒定結(jié)果。結(jié)果判定參照MALDI-TOF-MS結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)——結(jié)果可信度>60%，僅有1個(gè)鑒定選項(xiàng)，為好的鑒定；可信度>60%，但有2～4個(gè)鑒定選項(xiàng)，為低分辨率的鑒定，需要補(bǔ)充水解七葉苷試驗(yàn)[9]予以區(qū)分；可信度<60%；有4個(gè)以上鑒定選項(xiàng)或無(wú)鑒定選項(xiàng)，為不能鑒定。

1.5 16S rRNA測(cè)序

按照TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行DNA提取，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR正向引物27F：5′ -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ ，反向引物1492R：5′ -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′ 。擴(kuò)增體系含2×Taq mix 15 μL、正向引物（10 μmol/L）2 μL、反向引物（10 μmol/L）2 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 10 μL，加無(wú)菌純水至30 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上成像。將片段大小約為1 500 bp的目標(biāo)條帶送至北京六合華大基因公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行Blast比對(duì)，將序列同源性>97%（按16S rRNA基因序列）的菌株歸為同一菌種[10]。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用Etest法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。用無(wú)菌棉簽挑取待測(cè)菌株菌落3～5個(gè)置于無(wú)菌鹽水中，配制成相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙骸Ｓ脽o(wú)菌棉簽蘸取上述菌液均勻涂布在含5%羊血的M-H培養(yǎng)基上（操作方法同紙片擴(kuò)散法），靜置3～5 min后，將Etest條垂直插入培養(yǎng)基中，于35 ℃下孵育16～20 h，讀取橢圓形抑菌圈邊緣與Etest條交叉處的藥物濃度，即該藥對(duì)該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行處理，其結(jié)果判定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2015年的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

2株菌株在哥倫比亞血平板上生長(zhǎng)，在麥康凱平板上不生長(zhǎng)。孵育24 h時(shí)，菌落較??；孵育48 h時(shí)，菌落明顯增加，且呈奶白色，較為黏稠；細(xì)菌菌落數(shù)均超過(guò)105 CFU/mL。挑取菌落行革蘭氏染色鏡檢，顯微鏡下為革蘭氏陽(yáng)性棒狀桿菌，排列不規(guī)則，多呈柵欄樣或八字形排列，詳見圖1。

2.2 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為解葡萄糖苷棒狀桿菌，可信度為99.9%，且僅有1個(gè)鑒定選項(xiàng)。該菌在m/z 2 431、3 089、3 364、3 378、4 200、5 508、6 302、6 637、6 730、6 946、12 603處出現(xiàn)特征峰，詳見圖2。

2.3 16S rRNA測(cè)序結(jié)果

將2株菌株的16S rRNA測(cè)序結(jié)果（圖3）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)。結(jié)果顯示，2株菌株與GenBank中已知解葡萄糖苷棒狀桿菌（基因登錄號(hào)：GG667131.1）的序列同源性超過(guò)98%，屬于同一菌種，詳見圖4。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌株1對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)青霉素G等其他14種抗菌藥物敏感；菌株2對(duì)頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素耐藥，對(duì)頭孢噻肟中介，對(duì)其他10種抗菌藥物敏感，詳見表1。

3 討論

解葡萄糖苷棒狀桿菌引起的感染較為少見，可引起非淋菌性尿道炎、結(jié)痂性膀胱炎、前列腺炎、肉芽腫性乳腺炎等[5，12-13]。該菌也可從血液和腹腔液中分離，但極為罕見[13]；此外，該菌除可從人泌尿生殖道中檢出外，還可從另外一種哺乳動(dòng)物豬的泌尿生殖道中檢出[14]。

棒狀桿菌引起的感染往往具有爭(zhēng)議，因?yàn)榇蠖鄶?shù)棒狀桿菌是皮膚定植菌。本研究從2例泌尿系統(tǒng)結(jié)石患者的尿液標(biāo)本中分離得到了2株解葡萄糖苷棒狀桿菌。患者多次送檢尿液標(biāo)本，病原菌大量生長(zhǎng)，尿沉渣分析顯示其存在菌尿，且尿白細(xì)胞增高，故考慮該菌可能是一種潛在的泌尿道病原菌。文獻(xiàn)報(bào)道解葡萄糖苷棒狀桿菌可引起青年男性尿道炎，該菌可從有臨床癥狀的患者中分離，不能視為泌尿生殖道的定植菌[13]。因此，當(dāng)棒狀桿菌在臨床標(biāo)本中優(yōu)勢(shì)大量生長(zhǎng)或者在生理無(wú)菌部位大量生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)評(píng)估其致病性，并進(jìn)行鑒定。同時(shí)，解葡萄糖苷棒狀桿菌生長(zhǎng)緩慢，應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，避免漏檢[5]。

棒狀桿菌和疾病之間的關(guān)系依賴于菌種的準(zhǔn)確鑒定[15]。然而，棒狀桿菌鑒定到種卻較為困難，傳統(tǒng)的生化鑒定方法操作煩瑣、耗時(shí)，且無(wú)法提供可靠的結(jié)果[1]。分子測(cè)序技術(shù)是鑒定棒狀桿菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且需要檢測(cè)人員接受專門培訓(xùn)，故不能在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用[1]。因此，一些基層醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定棒狀桿菌往往局限于種屬或描述性報(bào)告（如：革蘭氏陽(yáng)性桿菌）。棒狀桿菌不能準(zhǔn)確鑒定，其臨床意義可能被低估，治療將被延誤[7]。MALDI-TOF-MS是一種新型微生物鑒定技術(shù)，在鑒定細(xì)菌和酵母菌上具有準(zhǔn)確、快速、方便、成本低、高通量的優(yōu)點(diǎn)[16]。多項(xiàng)研究顯示，MALDI-TOF-MS能準(zhǔn)確將棒狀桿菌鑒定到種，且速度極快，每株菌株的鑒定在10 min內(nèi)即可完成[1，17]。MALDI-TOF-MS技術(shù)提高了微生物實(shí)驗(yàn)室的工作效率，對(duì)幫助認(rèn)識(shí)棒狀桿菌潛在的致病性、及時(shí)診斷和治療具有重要價(jià)值。

目前，關(guān)于解葡萄糖苷棒狀桿菌的藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道較少。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類、萬(wàn)古霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、利福平、利奈唑胺敏感，對(duì)克林霉素、紅霉素、四環(huán)素耐藥；對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星的MIC范圍廣，藥敏試驗(yàn)結(jié)果不定，可能是敏感、中介或耐藥[5，13，18]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株1對(duì)頭孢曲松、環(huán)丙沙星耐藥；菌株2則表現(xiàn)出多重耐藥性，對(duì)頭孢曲松、紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、克林霉素均耐藥，對(duì)頭孢噻肟中介，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[13]的結(jié)果相近。值得關(guān)注的是，2株菌株對(duì)紅霉素、四環(huán)素、克林霉素、頭孢噻肟的耐藥性存在差異。筆者認(rèn)為，菌株2對(duì)紅霉素耐藥的機(jī)制可能與藥物作用靶位的改變有關(guān)，該菌攜帶核糖體甲基化酶基因（如ermX），可使紅霉素作用的核糖體蛋白甲基化，藥物作用靶位核糖體50S亞基蛋白改變，藥物與靶位的親和力下降，導(dǎo)致耐藥。另外，由于大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽(yáng)菌素B等3種抗菌藥物在細(xì)菌的核糖體上有相似的作用位點(diǎn)，因此在此機(jī)制作用下，可導(dǎo)致菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和鏈陽(yáng)菌素B交叉耐藥[19-20]。菌株2對(duì)四環(huán)素耐藥的機(jī)制可能為：（1）核糖體保護(hù)蛋白基因（如tetW）的表達(dá)增強(qiáng)，大量生成的核糖體保護(hù)蛋白與核糖體相互作用，保護(hù)細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不受藥物影響[19]；（2）細(xì)菌產(chǎn)生四環(huán)素類藥物泵出基因（如tetAB），其表達(dá)的膜蛋白具有排出四環(huán)素-陽(yáng)離子復(fù)合物的作用，使菌體內(nèi)藥物濃度降低[20]。2株菌株對(duì)頭孢噻肟的敏感性不同，機(jī)制可能與青霉素結(jié)合蛋白（PBP）和第三代頭孢菌素的親和力下降、PBP增多或產(chǎn)生新的PBP使抗菌藥物失去活性等因素有關(guān)[21]。另外，2株菌株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥很可能是由gryA基因突變引起的[22]。鑒于2株解葡萄糖苷棒狀桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果差別較大，實(shí)驗(yàn)室有條件時(shí)應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以指導(dǎo)抗菌藥物的合理選擇。本次分離的2株菌株均來(lái)自于泌尿外科病區(qū)的不同患者。其中，1例患者（分離出菌株1）經(jīng)驗(yàn)性使用環(huán)丙沙星治療1周，癥狀無(wú)改善，尿培養(yǎng)仍檢出該菌，后依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整為復(fù)方磺胺甲噁唑治療1周，癥狀明顯改善，再次尿培養(yǎng)示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，患者痊愈出院。另1例患者（分離出菌株2）在經(jīng)驗(yàn)性使用環(huán)丙沙星治療無(wú)效的情況下，醫(yī)師依據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)結(jié)果更換為復(fù)方磺胺甲噁唑，雖然該藥MIC（0.125 μg/mL）并非最低，但治療效果較好，患者痊愈。

綜上所述，解葡萄糖苷棒狀桿菌是一種罕見的泌尿道病原菌，由該菌所致的感染應(yīng)引起臨床的重視。該菌對(duì)多種抗菌藥物耐藥，可導(dǎo)致診斷及治療時(shí)機(jī)的延誤。因此，微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡量進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，為患者的臨床治療提供參考。MALDI-TOF-MS技術(shù)在棒狀桿菌的鑒定上具有快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，是一種新型微生物鑒定技術(shù)，有望在不久的將來(lái)取代傳統(tǒng)的微生物鑒定方法。但本研究納入的解葡萄糖苷棒狀桿菌數(shù)量極少，藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)尚不能全面反映該菌的耐藥特征，加之鑒于該菌的高耐藥性及其對(duì)臨床的影響，繼續(xù)對(duì)解葡萄糖苷棒狀桿菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)非常必要。

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（收稿日期：2017-02-21 修回日期：2017-11-27）

（編輯：張?jiān)拢?/p>