吳永清　胡秀　梁韓枝　鄧莎　湯聰

摘要：[目的]篩選白花龍（Styrax faberi Perk.）的離體快繁最佳條件，為白花龍的推廣種植及生態(tài)環(huán)境修復(fù)提供參考依據(jù)。[方法]以切除或帶胚乳的白花龍種子為外植體、MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度GA₃進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)；以種子無(wú)菌萌發(fā)的莖段為外植體、MS為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選適宜白花龍叢生芽增殖培養(yǎng)的最佳6-BA、NAA和TDZ組合；以叢生芽增殖獲得的幼苗為外植體、Ms或1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA，采用直接或間接生根法，篩選白花龍組培苗生根的最佳基本培養(yǎng)基、IBA濃度和生根方法。[結(jié)果]帶胚乳的白花龍種子在添加不同濃度GA3條件下萌發(fā)15 d后子葉開始褐化，最終全部死亡；切除胚乳的白花龍種子在無(wú)激素條件下也可萌發(fā)，但以在MS+2.0 mg/L GA3培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，達(dá)97.5%。在繼代增殖階段，白花龍叢生芽在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大，為5.7。在生根階段，帶兩個(gè)節(jié)的白花龍莖段在200.0 mg/L IBA溶液中浸泡15 mind轉(zhuǎn)接至1/2MS空白培養(yǎng)基的生根率最高，達(dá)93.3%，平均生根數(shù)為7.1條。[結(jié)論]切除胚乳的白花龍種子在MS+2.0 mg/LGA3培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，其萌發(fā)的莖段在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大；采用間接生根法，可獲得生根效率較高、適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)的白花龍組培苗。

關(guān)鍵詞：白花龍；種子萌發(fā)；離體培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號(hào)：S685 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）03-0536-07

0引言

[研究意義]白花龍（Styrax faberi Perk.）屬安息香科（Styracaceae）安息香屬（Styrax）多年生落葉闊葉灌木，主要分布于安徽、湖北、江蘇、浙江、湖南、江西、廣東、廣西和臺(tái)灣等?。▍^(qū)）。其樹形優(yōu)美，是為數(shù)不多的春季開白花、形態(tài)富有奇趣的鄉(xiāng)土觀賞樹種，適用于小區(qū)、公園、道路等的綠化和邊坡生態(tài)修復(fù)（金建紅等，2009）。白花龍還是良好的藥用和油脂用植物，果實(shí)可治療頭暈發(fā)熱（陳少卿等，1982），根可用于治療胃脘痛，種子油可制造肥皂和潤(rùn)滑油（中國(guó)科學(xué)院華南植物研究所，1987；中國(guó)油脂植物編寫委員會(huì)，1987），葉片可用于止血、生肌和消腫（程家壽等，2011），具有廣闊的開發(fā)利用前景。白花龍種殼堅(jiān)硬且具有一定的休眠特性，萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)、萌發(fā)率和扦插繁殖成活率低，常規(guī)的種苗繁殖方式不能滿足市場(chǎng)需求（程家壽等，2011）。植物離體培養(yǎng)快速繁殖是獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗的有效途徑（段元杰等，2016；陸榮生等，2016；王林等，2016；吳雪娟等，2016；閆海霞等，2016；Solle and Semiarti，2016；林茂等，2017；劉曉等，2017；田奧磊等，2017），因此，建立白花龍高效離體培養(yǎng)快速繁殖體系，對(duì)白花龍的推廣種植及生態(tài)環(huán)境修復(fù)具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]安息香科植物種子普遍具有休眠特性，不能隨采隨播（國(guó)家林業(yè)局國(guó)有林場(chǎng)和林木種苗工作總站，2001），如白花樹[（S.tonkinensis（Pierre）Craibex Hartw.）]的種子在常溫下儲(chǔ)藏5個(gè)月后發(fā)芽率僅20%（劉志強(qiáng)等，2001），激素處理配合低溫層積也不能獲得滿意的發(fā)芽效果，如垂珠花（S. dasyanthusPerk.）經(jīng)1200 mg/L GA3預(yù)處理24 h結(jié)合低溫沙藏層積，發(fā)芽率僅44%（丁芳芳，2013）。王奎玲等（2010）、陳甜甜等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，玉鈴花（S.obassia）腋芽增殖階段最適宜的培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，前者的增殖系數(shù)為5.56，但后者的僅為3.19。張亮亮等（2013）對(duì)白花樹、王文君等（2016）對(duì)野茉莉（S. japonicus）、張琦等（2017）對(duì)賽山梅（S. confusus）的研究結(jié)果顯示，MS+0.3 mg/L 6-BA是增殖階段最適宜的培養(yǎng)基。在生根培養(yǎng)階段，多位學(xué)者均認(rèn)為適宜的基本培養(yǎng)基為1/2MS（王奎玲等，2010；張亮亮等，2013；王文君等，2016；張琦等，2017）。[本研究切入點(diǎn)]迄今，未見白花龍人工播種繁殖及離體培養(yǎng)繁殖的研究報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]通過去除白花龍種殼以增加透氣性和透水性、去除胚乳以降低萌發(fā)抑制物質(zhì)和誘導(dǎo)幼苗褐化死亡物質(zhì)含量，優(yōu)化其增殖和生根培養(yǎng)基的激素種類和濃度配比，以提高增殖率和生根率，實(shí)現(xiàn)白花龍的離體培養(yǎng)快速繁殖，為其推廣種植提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為白花龍成熟果實(shí)的種子，2015年10月采自廣東省博羅縣林業(yè)科學(xué)研究所林區(qū)。試驗(yàn)時(shí)間為2015年11月～2017年3月。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 MS培養(yǎng)基中蔗糖含量30.0 g/L，瓊脂含量6.0 g/L，pH 5.8～6.0。1/2MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，蔗糖含量30.0 g/L，瓊脂含量6.0 g/L。培養(yǎng)基在105 Kpa、121℃條件下高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.2種子萌發(fā) 脫去白花龍果實(shí)的果皮，將種子轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，用75%酒精浸泡1 min，無(wú)菌水清洗1遍后剝開外種殼，放入0.1%升汞中浸泡5 min，無(wú)菌水清洗6～8遍。接種時(shí)以帶胚乳和切除胚乳的種子為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度（0、1.0、2.0和3.0 mg/L）GA3進(jìn)行種子萌發(fā)。每處理10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體。接種45 d后統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)率和成苗率，觀察記錄苗的生長(zhǎng)狀況。

萌發(fā)率（%）=萌發(fā)外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

成苗率（%）=成活外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)×100

1.2.3繼代培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9（3⁴）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），分析6-BA、NAA和TDZ對(duì)白花龍無(wú)菌苗莖段增殖培養(yǎng)的影響。每處理10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體。45 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和平均苗高，記錄叢生芽的生長(zhǎng)情況。

增殖系數(shù)=增殖后芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)

平均苗高（cm）=增殖后苗總高度（cm）/接種外植體總數(shù)

1.2.4壯苗與生根 選取高于1.5 cm的白花龍叢生芽轉(zhuǎn)接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d以壯苗；選擇壯苗培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好的幼苗，切成帶兩個(gè)節(jié)的莖段用于直接或間接生根培養(yǎng)。直接生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS或I/2MS添加不同濃度（0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/L）IBA；間接生根培養(yǎng)是先將莖段置于較高濃度（100.0、200.0和300.0 mg/L）IBA溶液中浸泡15 min，再轉(zhuǎn)至MS或I/2MS空白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。每處理6瓶，每瓶接種5個(gè)外植體。45 d后統(tǒng)計(jì)平均生根數(shù)，計(jì)算生根率，記錄根的生長(zhǎng)情況。

平均生根數(shù)=根總數(shù)/接種數(shù)

生根率（%）=生根的苗數(shù)/接種數(shù)×100

1.2.5煉苗和移栽 選擇健壯、側(cè)根發(fā)達(dá)的幼苗，置于蔭棚內(nèi)煉苗，7 d后將幼苗移栽于泥炭土：珍珠巖：沙=3：1：1的基質(zhì)中，30 d后觀察植株生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)成活率。

成活率（%）=成活苗數(shù)/苗總數(shù)×100

1.3統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以Duncans進(jìn)行多重比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1GA₃對(duì)白花龍種子萌發(fā)的影響

由表2可知，帶胚乳的種子在不添加任何激素或添加不同濃度GA3條件下，約1個(gè)月開始萌發(fā)，且萌發(fā)15 d后子葉開始褐化，最終全部死亡（圖1-A），其萌發(fā)時(shí)間隨GA3濃度的增加而明顯縮短，萌發(fā)率呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)GA3濃度為2.0 mg/L時(shí)，萌發(fā)率最高，但僅為20.0%；切除胚乳的白花龍種子在不添加任何激素或添加不同濃度GA₃時(shí)，一周內(nèi)開始萌發(fā)，成苗率均高于80.0%，其萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率和成苗率均顯著高于帶胚乳種子（P<0.05，下同），萌發(fā)率和成苗率隨GA3濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)GA3濃度為2.0 mg/L時(shí)，萌發(fā)時(shí)間最短（僅需3.0 d），萌發(fā)率和成活率最高，均達(dá)97.5%，且顯著高于其他濃度處理，幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖1-B）。說明白花龍種子胚乳中含有抑制種子萌發(fā)和導(dǎo)致幼苗褐化的物質(zhì)，影響了胚的萌發(fā)率和萌發(fā)速度。

2.2不同激素配比對(duì)白花龍繼代增殖的影響

由表3可知，培養(yǎng)基為0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA，即在6-BA與NAA的濃度比為10：1、且激素濃度較低時(shí)，白花龍叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)5.7，芽長(zhǎng)勢(shì)較好（圖1-C）；培養(yǎng)基為1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LNAA，即調(diào)高6-BA與NAA的絕對(duì)濃度但仍保持較低比例時(shí)，增殖系數(shù)僅為4.0；而培養(yǎng)基為0.5 mg/L6-BA+0.01 mg/L NAA，即調(diào)高6-BA與NAA的濃度比但仍保持低絕對(duì)濃度時(shí)，增殖系數(shù)更低，僅3.3。說明增殖培養(yǎng)基中6-BA與NAA的濃度比及絕對(duì)濃度均較低時(shí)，可獲得增殖系數(shù)較高的白花龍叢生芽。

由表3可知，白花龍叢生芽的增殖系數(shù)為2.9～5.7；高濃度（1.0和2.0 mg/L）6-BA/～導(dǎo)致白花龍幼苗出現(xiàn)玻璃化和畸形葉現(xiàn)象。比較極差值R，影響繼代增殖的因子排序?yàn)锽>A>C，即在白花龍繼代增殖中發(fā)揮作用的激素排序?yàn)镹AA>6-BA>TDZ。比較K值，A因子以A₁、B因子以B₂、C因子以C₂的最大，為各因子的最優(yōu)水平。說明白花龍繼代增殖培養(yǎng)的最佳激素組合為AIBzC2，即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA為白花龍叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.3不同基本培養(yǎng)基、生根方法和IBA濃度對(duì)白花龍生根培養(yǎng)的影響

由表4可知，以MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，白花龍的幼苗經(jīng)200.0 mg/L IBA溶液浸泡1 5 min后培養(yǎng)45 d，雖能獲得93.3%的生根率和6.3條的生根數(shù)，但無(wú)根毛產(chǎn)生，根的質(zhì)量也一般；以I/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，白花龍的幼苗有根毛產(chǎn)生，根質(zhì)量好。對(duì)比白花龍直接生根法和間接生根法的效果發(fā)現(xiàn)，直接生根所需時(shí)間明顯較長(zhǎng)、生根率明顯較低、生根數(shù)明顯較少（圖1-D）；間接生根法能極大縮短生根時(shí)間、提高生根率和生根數(shù)，根較粗壯。激素處理方面，白花龍幼苗在200.0 mg/L IBA溶液中浸泡15 min后接種于1/2Ms空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)45 d，生根率為93.3%，生根數(shù)為7.1條，且有根毛產(chǎn)生（圖1-E）。說明以1/2MS為基本培養(yǎng)基，使用間接生根法更適合進(jìn)行白花龍生根培養(yǎng)，且以在200.0 mg/L TBA溶液中浸泡15 min后轉(zhuǎn)接至1/2MS空白培養(yǎng)基上的效果最佳。

2.4煉苗移栽

用泥炭土：珍珠巖：沙（3：1：1）作基質(zhì)移栽白花龍生根培養(yǎng)后的健壯幼苗，30 d后移栽成活率為85.0%，小苗生長(zhǎng)狀況良好（圖1-F）。

3討論

安息香科植物種子普遍含有導(dǎo)致種子休眠的抑制物質(zhì)（國(guó)家林業(yè)局國(guó)有林場(chǎng)和林木種苗工作總站，2001），如垂珠花種子各部位均含有不同濃度的萌發(fā)抑制物，抑制活性排序?yàn)榉N胚>胚乳>種皮（丁芳芳，2013）；白花樹種子的萌發(fā)抑制物主要存在于胚乳中，在其離體培養(yǎng)過程中切除胚乳可降低外植體的污染率，縮短發(fā)芽時(shí)間，提高成活率（張亮亮等，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)，切除胚乳的白花龍種子萌發(fā)速度明顯比帶胚乳的種子快，說明白花龍種子的萌發(fā)抑制物也主要存在于胚乳中。張亮亮等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，白花樹帶胚乳的種子可正常萌發(fā)并成苗，本研究的白花龍帶胚乳種子萌發(fā)后約15 d開始褐化，最后整個(gè)種子壞死，說明白花龍胚乳中不僅含有萌發(fā)抑制物，還含有導(dǎo)致其組培苗褐化的物質(zhì)。已有研究表明，高濃度ABA是導(dǎo)致白花樹種子休眠的主要原因（吳君等，2014），層積沙藏處理（司倩倩等，2017）或GA3、NAA和6-BA等處理（許曉崗等，2012）均可打破由ABA引起的休眠。本研究以切除胚乳的白花龍種子為外植體，減少了種子中抑制萌發(fā)和導(dǎo)致組培苗褐化物質(zhì)的含量，可加快種子萌發(fā)速度，提高萌發(fā)率，但對(duì)胚乳中萌發(fā)抑制物的具體成分及含量有待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA最適于白花龍叢生芽增殖（增殖系數(shù)為5.7），其中的6-BA與NAA的濃度比為10：1，而培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA中6-BA與NAA的濃度比同樣為10：1，其芽的增殖系數(shù)僅為4.0，說明增殖系數(shù)低主要由激素絕對(duì)濃度過高引起，低比例、低絕對(duì)濃度的6-BA與NAA結(jié)合有利于白花龍繼代增殖。張亮亮等（2013）、王文君等（2016）、張琦等（2017）采用6-BA（0、0.3、1.0、3.0 mg/L）與NAA（0、0.30、1.00、3.00 mg/L）組合分別對(duì)同屬植物白花樹、野茉莉和賽山梅進(jìn)行叢生芽增殖，結(jié)果表明，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增大，增殖系數(shù)呈遞減趨勢(shì)；當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的增大，增殖系數(shù)也呈遞減趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-B+0 mg/L NAA時(shí)，即6-BA與NAA的濃度比為30：0時(shí)，芽的增殖系數(shù)最高，表明低比例、低絕對(duì)濃度的6-BA與NAA有利于白花樹、野茉莉和賽山梅芽增殖。本研究結(jié)果與其一致。

蔣澤平等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，秤錘樹的幼苗在含有高濃度（2.0 mg/L）6-BA的培養(yǎng)基中增殖時(shí)，幼苗出現(xiàn)爛心、玻璃苗現(xiàn)象。雷穎等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度越高，松潘烏頭（Aconitum sungpanenseHand-Mazz.）叢生芽增殖苗的玻璃化率越高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，白花龍叢生芽增殖的幼苗在含有相對(duì)高濃度（1.0～2.0 mg/L）6-BA的培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)不佳，也出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

以木本植物進(jìn)行組織培養(yǎng)普遍較難生根，如馬來沉香（Aquilaria malaccensis）生根培養(yǎng)的最高生根率僅56.7%（張衛(wèi)華等，2014），但進(jìn)行一定濃度的IBA處理可促進(jìn)生根（Rathore and Phulwaria，2015；王婷婷等，2017；姚志紅等，2017）。本研究在1/2MS基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L IBA進(jìn)行白花龍組培苗直接生根培養(yǎng)的生根效果最好，隨著IBA濃度的增加，生根率和生根數(shù)均呈下降趨勢(shì)，說明含有高濃度IBA的培養(yǎng)基會(huì)抑制白花龍植株根系生長(zhǎng)，利用IBA促進(jìn)木本植物生根需控制IBA的使用濃度。張亮亮（2013）采用間接生根法進(jìn)行白花樹生根培養(yǎng)的生根率比直接生根法有所提高，但僅為60.0%，生根數(shù)也僅有2.4條。本研究結(jié)果與其相似，用直接生根方式進(jìn)行白花龍生根培養(yǎng)的生根效果也不佳，采用間接生根方法時(shí)，生根時(shí)間縮短（僅需3 d），生根率提高至93.3%，平均生根數(shù)增至7.1條，說明高濃度IBA能促進(jìn)木本植物根原基形成，低濃度IBA能促使根原基伸長(zhǎng)。

已有研究表明，礦物元素濃度較低時(shí)有利于組培苗生根（Baskaran and Jayabalan，2005）。本研究結(jié)果支持其觀點(diǎn)，以Ms為基本培養(yǎng)基時(shí)，誘導(dǎo)的白花龍根較細(xì)弱且無(wú)根毛，以礦質(zhì)元素含量較低的1/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，誘導(dǎo)得到根較粗壯、有根毛、能較長(zhǎng)時(shí)間保持較強(qiáng)生長(zhǎng)勢(shì)的白花龍幼苗。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，白花龍種子胚乳中含有抑制種子萌發(fā)和導(dǎo)致幼苗褐化死亡的物質(zhì)；切除胚乳的白花龍種子在Ms+2.0 mg/L GA，培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，其萌發(fā)的莖段在Ms+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/LNAA培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大；采用間接生根法可獲得生根效率較高、適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)的白花龍組培苗。

（責(zé)任編輯 思利華）